核供體細(xì)胞體外培養(yǎng)及其對豬克隆胚生產(chǎn)效率的影響.pdf

1、體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景，對于培育優(yōu)良畜種、生產(chǎn)同質(zhì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、保護(hù)瀕危動(dòng)物、進(jìn)行治療性克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)等方面，均有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值，現(xiàn)已有多種體細(xì)胞被用以獲得克隆后代。體細(xì)胞克隆豬在人類動(dòng)物疾病模型和異種器官移植方面具有巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力，已成為當(dāng)今體細(xì)胞克隆領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，雖然體細(xì)胞克隆豬業(yè)已取得不少進(jìn)展，但核移植技術(shù)仍存在許多問題，如總體效率低、流產(chǎn)率高及克隆動(dòng)物異常發(fā)育等。在哺乳動(dòng)物體細(xì)

2、胞核移植中，供體細(xì)胞是影響其效率的主要因素之一。該文著重從供核細(xì)胞體外培養(yǎng)、細(xì)胞類型、體外傳代次數(shù)等方面研究供核細(xì)胞及其對體細(xì)胞核移植效率的影響。 采用組織塊法和胰酶消化法分離培養(yǎng)4種供核體細(xì)胞：豬胎兒成纖維細(xì)胞、豬卵丘細(xì)胞、豬顆粒細(xì)胞及豬耳皮膚成纖維細(xì)胞。比較2種方法對上述4種體細(xì)胞的冷凍效果，方法A將細(xì)胞放在4℃冰箱中平衡0.5 h，-20℃2h，置于-70℃低溫冰箱中過夜后，將細(xì)胞冷凍管直接投入液氮中保存。方法B則用細(xì)胞冷

3、凍盒進(jìn)行冷凍保存，將冷凍管放入NALGENE冷凍盒中，置于-70℃低溫冰箱中過夜后，將細(xì)胞冷凍管直接投入液氮中保存。在用于核移植以前，我們對細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)變化；采用MTT法檢測其細(xì)胞活力，并繪制了細(xì)胞生長曲線；同時(shí)進(jìn)行核型分析檢測。我們以體外成熟培養(yǎng)40～44 h的去核卵母細(xì)胞為受體，體外培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、耳皮膚成纖維細(xì)胞為核供體構(gòu)建重構(gòu)胚。重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)7d，觀察其卵裂率及胚胎發(fā)育情況。結(jié)果

4、表明： 1.在所培養(yǎng)的4種體細(xì)胞中，采用方法B的細(xì)胞存活率和貼壁率均明顯高于方法A(P<0.05)，方法B為體細(xì)胞冷凍保存的最佳方案。 2.所培養(yǎng)的4種體細(xì)胞在體外的生長增殖過程均呈“S”型曲線變化，經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)增長期和平臺期3個(gè)階段，符合細(xì)胞在體外生長的一般規(guī)律。傳代后滯留期較短，約有1d左右，活細(xì)胞逐漸貼壁生長。此后進(jìn)入對數(shù)生長期，延續(xù)6d左右。培養(yǎng)8d后細(xì)胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡，其數(shù)量進(jìn)入平臺期，并逐漸脫落

5、死亡，導(dǎo)致數(shù)量下降。 3.染色體檢測表明，在適宜的培養(yǎng)體系胎兒成纖維細(xì)胞至少可以傳至8代并保持染色體倍性正常，卵丘細(xì)胞至少可以傳至5代并保持染色體倍性正常；顆粒細(xì)胞至少可以傳至5代并保持染色體倍性正常；耳皮膚成纖維細(xì)胞，至少可以傳至6代并保持染色體倍性正常。該結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)傳代后均可保持核型穩(wěn)定正常，適合用作體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞。 4.本實(shí)驗(yàn)采用豬胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及耳皮膚成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行核移植，比

6、較不同細(xì)胞類型對豬體細(xì)胞核移植效率的影響，結(jié)果顯示核移植后都能得到體細(xì)胞克隆的桑囊胚，胎兒成纖維細(xì)胞(70.2％)、顆粒細(xì)胞(73.3％)和卵丘細(xì)胞(82.5％)作為核供體的卵裂率均顯著高于耳成纖維細(xì)胞(61.2％)；顆粒細(xì)胞(38.6％)和卵丘細(xì)胞(47.6％)所獲得的桑囊胚率顯著高于耳成纖維細(xì)胞(28.4％，P<0.05)。 5.以不同代次的豬胎兒成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及耳成纖維細(xì)胞為核供體進(jìn)行核移植，比較不同傳代次數(shù)對核移植

7、效率的影響。結(jié)果顯示以豬胎兒成纖維細(xì)胞不同培養(yǎng)代數(shù)做供體進(jìn)行核移植，第2代的豬胎兒成纖維細(xì)胞(79.0％)作為核供體細(xì)胞獲得的卵裂率顯著高于第3代(58.1％，P<0.05)，而兩者獲得的桑椹胚、囊胚發(fā)育率差異不顯著。用傳至3代的顆粒細(xì)胞作核供體的卵裂率顯著低于原代及前2代細(xì)胞(P<0.05)；但在桑囊胚發(fā)育率上，第2代的細(xì)胞顯著高于其它代次(P<0.05)。用不同代次的耳成纖維細(xì)胞作為核供體獲得的卵裂率差異不顯著，但在桑囊胚發(fā)育率上，

8、原代(36.8％)及第3代細(xì)胞(44.1％)顯著高于第1代(10.5％)和第2代(13.5％)細(xì)胞(P<0.05)。 6.本實(shí)驗(yàn)獲取作為供核細(xì)胞的豬卵丘細(xì)胞方法有2種。(1)直接從成熟卵母細(xì)胞周圍分離得到卵丘細(xì)胞；(2)卵丘細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)傳代4代的卵丘細(xì)胞，以重建胚早期發(fā)育率為指標(biāo)，比較2種供核細(xì)胞對豬核移植效果的影響。結(jié)果表明，直接分離的卵丘細(xì)胞作為核供體獲得的卵裂率與培養(yǎng)傳代的卵丘細(xì)胞差異不顯著，而直接分離的卵丘細(xì)胞(47