急性白血病p53基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化的研究.pdf

1、本文旨在觀察p53基因P1啟動(dòng)子甲基化在急性白血病中的存在情況及其在ANLL與ALL中的異同，并結(jié)合臨床資料，探討p53基因甲基化檢測(cè)在急性白血病診療方面的意義。 材料與方法： 實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株；急性白血病初發(fā)或者復(fù)發(fā)以及慢性白血病急性變患者的骨髓或者外周血標(biāo)本共3l例；健康體檢自愿者外周血標(biāo)本共11例供對(duì)照。 1、U937細(xì)胞培養(yǎng)與標(biāo)本收集 使用RPMI1640培養(yǎng)液(10﹪的小

2、牛血清)，37℃，5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)1.0×10<'6>/mL時(shí)收獲細(xì)胞。 經(jīng)患者或者健康體健者同意，取骨髓或者外周血約2mL常規(guī)抗凝，分裝成500μL于EP管中-80℃保存標(biāo)本。 2、DNA的提取與檢測(cè) 按美國(guó)Omega公司的E．Z．N．A Tissue DNA Kit提取試劑盒的步驟進(jìn)行細(xì)胞或骨髓標(biāo)本的DNA提取，獲得的DNA樣品分裝后放入-30℃冰箱保存?zhèn)溆谩＋@取的D

3、NA樣品在核酸蛋白分析儀上行濃度及純度的檢測(cè)。使用0.5﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的完整性：將需要檢測(cè)的DNA樣品電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察DNA的質(zhì)量。 3、限制性內(nèi)切酶酶切消化 MspI、HpaII、EcoRII的反應(yīng)體系均由1 μ g提取的基因組DNA與足夠量相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)緩沖液等組成50μL的反應(yīng)體系，37℃過夜酶切。BstN I的反應(yīng)體系由1 μ g提取的基因組DNA與1μL限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)緩沖液

4、等組成50μL的反應(yīng)體系，60℃過夜酶切。所有酶切后產(chǎn)物經(jīng)加熱滅活后行下一步實(shí)驗(yàn)。 4、引物設(shè)計(jì) (1)、p53基因的引物設(shè)計(jì)本論文研究的p53基因CCGG的甲基化位點(diǎn)位于883位(GenBank sequenceno.X54156)，CCWGG位于756，858，和940(GenBank sequence no．X54156)。p53基因擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)資料，然后經(jīng)過Primer5.0軟件改進(jìn)。最終設(shè)計(jì)引物如下：正義5

5、’GGCGGATTACTTGCCCTTAC 3’；反義5’AGCCCGTGA CTCAGAGAGGAC3’ (2)、內(nèi)參照β-actin基因的引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0軟件對(duì)β-actin基因(NCBI登錄號(hào)BC013835)進(jìn)行酶切分析，先找出這四種限制性內(nèi)切酶(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)均不能切開的序列。選取其中一段，然后對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。最終選擇Tm值與目的基因相近、產(chǎn)物與目的基因相差至少l

6、OObp的引物序列。正義為：5’GTCCACCGCAAATGCT TCTA 3’；反義：5’GC從TGCTATCACCTCCCCT 3’。 5、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物鑒定 分別以酶切后產(chǎn)物(Msp Ⅰ、npa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因組DNA為模板分別行目的片段及參照片段的PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳后在凝膠成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀測(cè)電泳條帶及攝像；部分標(biāo)本的電泳條帶經(jīng)凝膠回收純化后進(jìn)行測(cè)序。 6、標(biāo)本臨床資料的處理

7、 新收集的骨髓片或者血片經(jīng)瑞氏染色后鏡檢，經(jīng)確認(rèn)為符合要求的標(biāo)本后行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；所有標(biāo)本的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷由各醫(yī)院的血液實(shí)驗(yàn)室完成；病人的其余臨床資料通過病案室查取。 結(jié)果： 1、U937細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果： 倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；行細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果約為6×10<'6>/個(gè)mL。 2、DNA的檢測(cè)：所提取DNA標(biāo)本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)符合要求(純度：OD260/OD2801.7-2

8、.0)；提取的急性白血病患者基因組DNA直接電泳，結(jié)果無散在片段，表明無降解。 3、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物鑒定結(jié)果：分別以酶切后產(chǎn)物(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ的酶切位點(diǎn)均為CCGG位點(diǎn)，但是Msp Ⅰ不受甲基化的影響，而Hpa Ⅱ受甲基化的影響，即如果CCGG位點(diǎn)存在甲基化，Msp Ⅰ酶切后產(chǎn)物為模板的PCR反應(yīng)不能擴(kuò)增出片段，而Hpa，Ⅱ酶切后產(chǎn)物

9、為模板的PCR反應(yīng)即可以擴(kuò)增出片段；如果CCGG位點(diǎn)不存在甲基化，則兩個(gè)反應(yīng)均無擴(kuò)增片段：同理，EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ也是有相同的酶切位點(diǎn)CCWGG，結(jié)果分析同上。部分標(biāo)本電泳后目的條帶經(jīng)凝膠回收后行產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BLAST比對(duì)結(jié)果為符合要求擴(kuò)增的片段：表明擴(kuò)增產(chǎn)物即為所需擴(kuò)增的p53基因的目的片段。 4、病例的臨床資料 通過查詢可能與急性白血病治療效果相關(guān)或者預(yù)后相關(guān)的信息，包括年齡、性別，診斷分型，流式細(xì)

10、胞學(xué)檢查結(jié)果，初診時(shí)患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)；是否伴有感染、出血；是否伴有其他臟器疾?。皇欠裼懈纹⒘馨徒Y(jié)腫大的情況；2療程標(biāo)準(zhǔn)化療是否達(dá)到完全緩解等。 5、急性白血病患者p53基因甲基化檢測(cè)結(jié)果 急性白血病患者p53基因第一啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為38.7﹪，而急性淋巴細(xì)胞白血病與急性非淋巴細(xì)胞白血病患者分別為45.5﹪，35﹪。正常對(duì)照標(biāo)本中未檢測(cè)到p53基因的異常甲基化。 p53基因甲基化情況在急性白

11、血病病人與正常人之間經(jīng)過Fisher精確概率檢驗(yàn)，p=0.0183<0.05，表明差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即病人與正常人之間甲基化陽(yáng)性數(shù)不同。急性淋巴細(xì)胞白血病與急性非淋巴細(xì)胞白血病患者之間經(jīng)過Fisher。精確概率檢驗(yàn)比較P=0.7054)0.05，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明p53甲基化陽(yáng)性率在ALL與ANLL之間無差別。 6、急性白血病患者p53基因甲基化與臨床的關(guān)系 分析急性白血病患者p53基因甲基化與患者年齡、外周血白細(xì)胞

12、計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板、是否伴有出血、感染、肝脾淋巴結(jié)是否腫大等之間的關(guān)系。其中，p53基因異常甲基化與肝脾是否腫大之間的關(guān)系經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算P<0.05，表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、部分急性白血病患者存在p53基因第一啟動(dòng)子異常甲基化，正常對(duì)照中未檢測(cè)到p53基因的甲基化： 2、p53基因第一啟動(dòng)子在急性淋巴細(xì)胞白血病與急性非淋巴細(xì)胞白血病均可發(fā)生異常甲基化，兩者之間發(fā)生甲基化的概率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、