下調(diào)前列腺干細(xì)胞抗原表達(dá)對人前列腺癌細(xì)胞PC-3M生長及侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤。我國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢，且增長比歐美發(fā)達(dá)國家更為迅速，已成為泌尿外科領(lǐng)域一個(gè)越來越重要的課題。前列腺癌具有侵襲性生長的生物學(xué)特性，臨床上有許多患者就診時(shí)已經(jīng)有癌的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，而相當(dāng)多數(shù)局限性前列腺癌患者在以治愈為目的的根治性治療（根治性前列腺切除術(shù)、根治性放療）后幾乎不可避免地發(fā)生生化復(fù)發(fā)，并最終進(jìn)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移性生長目前仍然是前列腺癌患者死亡的主要原因。因此，深

2、入闡明前列腺癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)，為前列腺癌的治療提供新的途徑具有重要意義。前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）基因是首次從人前列腺癌異種移植瘤動(dòng)物模型LAPC-4鼠中分離得到的一個(gè)新基因，并特異性表達(dá)于前列腺癌組織中。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)PSCA基因表達(dá)不僅與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且與臨床前列腺癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。我們前期體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)利用RNAi技術(shù)抑制PSCA基因表達(dá)，可抑制PC-3M細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力。

3、本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究其在生物體內(nèi)中的作用，通過篩選穩(wěn)定沉默PSCA的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M-PSCA(-)，將其接種在重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠皮下，觀察PSCA-shRNA對移植前列腺癌生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響。
　　研究目的：
　　觀察shRNA介導(dǎo)沉默PSCA表達(dá)對SCID鼠荷人前列腺癌皮下移植瘤的影響，從而探討shRNA靶向沉默PSCA基因在轉(zhuǎn)移性前列腺癌治療中的意義。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　1、利

4、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo shRNA-PSCA轉(zhuǎn)染到內(nèi)源性高表達(dá)PSCA的前列腺癌PC-3M細(xì)胞中，熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察，G418加壓篩選單克隆細(xì)胞株，用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)鑒定并最終篩選單克隆前列腺癌細(xì)胞株。
　　2、將穩(wěn)定沉默PSCA的細(xì)胞株接種于SCID鼠皮下，動(dòng)態(tài)觀察其致瘤性及移植瘤的生長情況，并測量腫塊的長徑(a)和短徑(b)，按公式 V=a*b2/2計(jì)算移植瘤的體積，繪制移植瘤生長曲線。
　　3、四

5、周后，先行3.0T MR掃描，再處死并解剖小鼠，肉眼觀察全身組織和器官發(fā)生粘連及轉(zhuǎn)移的情況，記錄各組發(fā)生轉(zhuǎn)移的動(dòng)物的只數(shù)、轉(zhuǎn)移的臟器以及轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。
　　4、完整剝離腫瘤及分離MRI顯示可疑轉(zhuǎn)移器官，4％多聚甲醛液固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建表達(dá)綠色熒光且穩(wěn)定沉默 PSCA表達(dá)的單克隆前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M-PSCA(-)，PSCA蛋白抑制率為（77.48±3.73）%。

6、r>　　2、干擾組（shRNA組）的初始致瘤時(shí)間和完全致瘤時(shí)間較C組及NC組長；接種細(xì)胞第10天，shRNA組的成瘤率為40%（2/5只），較空白對照組（C組）的成瘤率100%（5/5只）、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組（NC組）的成瘤率80%（4/5只）均降低，但三組小鼠間移植瘤的體積（8.34±3.58mm3、23.38±32.04 mm3、3.24±5.26 mm3）無明顯差異（P=0.254）；第17天，三組小鼠全部致瘤，但shRNA組移植瘤體

7、積（49.44±32.03 mm3）顯著小于其余兩個(gè)對照組（409.32±203.01 mm3和333.58±149.74 mm3）（P=0.005），而對照組間無顯著性差異（P=0.431）；移植瘤生長曲線分析亦表明：自接種細(xì)胞第17天，干擾組移植瘤的生長被顯著抑制，與對照組比較具有顯著性差異（P=0.031），而對照組間無顯著差異（P=0.902）。
　　3、MRI及大體解剖結(jié)果顯示，shRNA組發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)量、轉(zhuǎn)移灶