表達(dá)禽呼腸孤病毒σB、σC蛋白的重組馬立克氏病毒的構(gòu)建.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)感染可以引起的雞和火雞的以關(guān)節(jié)炎、鍵鞘炎、吸收障礙為特征的免疫抑制病。該病可導(dǎo)致雞的死亡率增加、病雞增重減少、飼料轉(zhuǎn)化率下降、產(chǎn)蛋下降、孵化率/受精率降低，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外的研究表明目前使用的弱毒疫苗S1133仍可能具有一定的致病性，因此研制安全、有效的新型疫苗對(duì)ARV感染的防控具有重要意義。
　　本研究采用RT-PCR擴(kuò)增ARV GX/2010/1株的σB、σC

2、基因，定向克隆至pEASY-M1表達(dá)載體中;再分別將σB、σC基因的表達(dá)盒與含有馬立克氏病毒(MDV) CVI988疫苗毒株sorf1/sorf2序列pU/D載體相連，構(gòu)建含σB、σC基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pU/D-σB和pU/D-σC。分別將pU/D-σB和pU/D-σC與含有GFP報(bào)告基因的MDV CVI988基因組DNA以磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，通過(guò)篩選、純化獲得重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-σC。經(jīng)PCR、Wester

3、n blot和IFA分析，σB、σC基因分別正確插入到MDV CVI988毒株基因組中，并可以成功表達(dá)ARVσB蛋白和σC蛋白。
　　本研究評(píng)價(jià)了1日齡SPF雞接種重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-σC后對(duì)ARVGX/2010/1株及MDV RB1B超強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)效力。將70只1日齡SPF雞隨機(jī)分成5組:rMDV-σB免疫組、rMDV-σC免疫組、S1133疫苗免疫組、非免疫攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組，從發(fā)病率、死亡率、臨床癥

4、狀、病理組織學(xué)變化、對(duì)增重的影響和抗體水平等方面評(píng)價(jià)免疫效力。前兩組的試驗(yàn)雞1日齡時(shí)分別頸部皮下接種5000空斑形成單位(PFU)的r-MDV-σB和r-MDV-σC，第三組于7日齡接種1羽份的S1133疫苗;21日齡時(shí)，前四組試驗(yàn)雞均用1040EID50/雞的ARV GX/2010/1毒株攻擊，攻毒第14天進(jìn)行剖殺。結(jié)果顯示rMDV-σB免疫組和rMDV-σC免疫組在ARV攻毒后的發(fā)病率分別為40％和26.7％與非免疫攻毒對(duì)照組發(fā)病率

5、100％存在顯著差異(p＜0.05);攻毒前后(21日齡～35日齡)各免疫組增重差異不顯著(p＞0.05)，但S1133疫苗組和rMDV-σB免疫組增重小于rMDV-σC免疫組。經(jīng)臨床檢查，攻毒后rMDV-σC免疫組的脾臟病變較S1133疫苗免疫組和rMDV-σB免疫組輕微。
　　本研究還評(píng)價(jià)了r-MDV-σB和r-MDV-σC分別對(duì)MDV RB1B超強(qiáng)毒株攻擊的免疫保護(hù)效果。將80只1日齡SPF雞隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)組:rMDV-σ

6、B免疫組、rMDV-σC免疫組、CVI988/Rispens免疫組和攻毒對(duì)照組，每組20只試驗(yàn)雞;rMDV-σB免疫組、rMDV-σC免疫組和CVI988/Rispens免疫組的試驗(yàn)雞分別于1日齡時(shí)頸部皮下接種5000 PFU/雞的相應(yīng)疫苗;7日齡時(shí)，所有試驗(yàn)雞經(jīng)腹腔接種500 PFU/雞的MDV RB1B超強(qiáng)毒株。連續(xù)觀察90天，記錄各試驗(yàn)組雞的發(fā)病和死亡情況。rMDV-σB免疫組和rMDV-σC免疫組對(duì)MDVRB1B強(qiáng)毒株攻擊能夠提