C-EBPβ在脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)節(jié).pdf

1、肥胖癥是指體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布不均勻，體重增加，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。體重的增加，首先是脂肪細(xì)胞體積增大，然后脂肪細(xì)胞數(shù)目增多。脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加是由于脂肪組織中存在的干細(xì)胞定向?yàn)榍爸炯?xì)胞，后者在一定因素的作用下，分化為脂肪細(xì)胞而形成的。因此研究脂肪細(xì)胞分化機(jī)制對(duì)肥胖的治療具有重要意義。 C／EBPβ在脂肪細(xì)胞分化程序中起重要作用。在脂肪細(xì)胞分化程序的早期C／EBPβ即有表達(dá)，C／EBPβ首先始動(dòng)有絲分裂

2、克隆擴(kuò)增(mitoticc1onalexDansion，MCE)，生長(zhǎng)抑制的前脂肪細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，經(jīng)歷兩輪左右的有絲分裂，然后退出細(xì)胞周期，進(jìn)入細(xì)胞分化的終末階段，隨后C／EBPβ激活許多脂肪細(xì)胞表型基因(如，422／ap2：SCDl：Glut4：0b基因等)的共同轉(zhuǎn)錄激活因子C／EBPα和PPARγ基因的表達(dá)。C／EBPβ通過作用于C／EBPα和PPARγ啟動(dòng)子上的C／EBP調(diào)節(jié)元件發(fā)揮對(duì)C／EBPα和PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄激活作

3、用。有絲分裂克隆擴(kuò)增和C／EBPα以及PPARγ的表達(dá)對(duì)于脂肪細(xì)胞分化均是必需的。因此C／EBPβ通過促進(jìn)有絲分裂克隆擴(kuò)增和激活C／EBPα以及PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。 在脂肪細(xì)胞分化的早期，誘導(dǎo)分化后2個(gè)小時(shí)內(nèi)C／EBPβ雖有表達(dá)，但C／髓PB獲得DNA結(jié)合活性要經(jīng)過很長(zhǎng)一段時(shí)間的延遲。首先因?yàn)橐种埔蜃覥HOP-10與C／EBPβ相互作用，抑制C／EBPβ的DNA結(jié)合活性，其次處于低磷酸化狀態(tài)的C／EBPβ具

4、有很低的DNA結(jié)合活性。 CHOP-10是C／EBP家族成員的轉(zhuǎn)錄抑制因子，與C／EBPβ形成異二聚體后，抑制C／EBPβ的DNA結(jié)合活性。在生長(zhǎng)抑制的前脂肪細(xì)胞，CHOP-10表達(dá)很高，經(jīng)誘導(dǎo)分化后，CHOP-10表達(dá)下調(diào)，釋放與之形成二聚體的C／EBPβ，C／EBPβ可以進(jìn)一步磷酸化，獲得D№結(jié)合活性并結(jié)合到著絲粒衛(wèi)星DNA上，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。到目前為止，在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化早期，CHOP-10表達(dá)下調(diào)的原因和機(jī)制還不清楚，

5、本文將對(duì)此做進(jìn)一步的研究。 C／EBPBThrl88為MAPK磷酸化位點(diǎn)，對(duì)C／EBPβ的DNA結(jié)合活性是必需的，但并不足以激活靶基因。采用MS／MS，我們又鑒定了兩個(gè)可能的GSK3B磷酸化位點(diǎn)：Ser84和仆r179。GSK3β磷酸化位點(diǎn)的特征：在其C末端4個(gè)氨基酸左右的氨基酸殘基首先發(fā)生磷酸化后，GSK3β才能發(fā)揮作用。我們對(duì)C／EBPβSerl84和Thr179位點(diǎn)的磷酸化特征及磷酸化后的C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄

6、激活功能進(jìn)行了深入研究，以確定C／EBPβSer184和Thr179位點(diǎn)能否被GSK3B磷酸化；β磷酸化；C／EBPβSerl84和Th179位點(diǎn)的磷酸化是否依賴于MAPK對(duì)C／EBPβThr188的磷酸化；C／EBPβ的順序磷酸化(首先MAPK磷酸化Thr188位點(diǎn)，然后GSK3β磷酸化Serl84或Thr179位點(diǎn))或C／EBPβ的高磷酸化狀態(tài)對(duì)C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄激活功能的影響。 一、CHOP-10在脂肪細(xì)胞

7、分化過程中的表達(dá)調(diào)節(jié) 在脂肪細(xì)胞分化的初期，CHOP-10表達(dá)下調(diào)對(duì)于C／EBPβ功能的發(fā)揮具有重要意義，因此我們對(duì)CHOP-10表達(dá)下降的原因進(jìn)行了深入的研究。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，引入了不同的誘導(dǎo)劑(MDI)，包括0．5mM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobuty-1-methylxantine，mx)，lμM的地塞米松(Dexamethasone，Dex)，1μg／m1胰島素(Insulin，I)

8、，并將小牛血清換成了胎牛血清，這種改變可能是造成在脂肪細(xì)胞分化早期CHOP-10表達(dá)下調(diào)的原因。為此我們檢測(cè)了不同誘導(dǎo)劑單獨(dú)(M，D，I)及不同組合(MD，MI，ID，MDI)對(duì)CHOP-10表達(dá)的影響。結(jié)果表明，10％胎牛血清(Fetalbovineserum，陽S)本身就足以使CHOP-10表達(dá)下調(diào)。而作為對(duì)照的10％小牛血清(Calfserum，CS)使CHOP-10維持在很高水平。胎牛血清引起CHOP-10表達(dá)下調(diào)對(duì)于3T3-L

9、1前脂肪細(xì)胞的分化起很重要的作用。因?yàn)橛眯∨Ｑ逄娲ヅＱ逭T導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化，使CHOP-10持續(xù)維持在很高的水平，脂肪細(xì)胞分化受到明顯抑制，脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)起始明顯延遲，表達(dá)的強(qiáng)度也明顯減弱。在本試驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)CHOP-10的表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)周期的關(guān)系不是絕對(duì)的，因?yàn)樵谛∨Ｑ宓恼T導(dǎo)分化方案中，即使細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期(MCE)，細(xì)胞仍有很高水平CHOP-10的表達(dá)，而在胎牛血清中培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞，即使當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到接觸抑制

10、后，細(xì)胞內(nèi)CHOP-10仍處于極低水平。以上結(jié)果提示，胎牛血清能下調(diào)生長(zhǎng)抑制的前脂肪細(xì)胞CHOP-10的表達(dá)，而小牛血清能維持生長(zhǎng)抑制的前脂肪細(xì)胞CHOP-10的表達(dá)。 二、FBS引起CHOP-10表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 在脂肪細(xì)胞分化的初期，CHOP-10的表達(dá)下調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)錄水平FBS對(duì)CHOP-10的調(diào)節(jié)。我們構(gòu)建了CHOP-10全長(zhǎng)啟動(dòng)子及5’系列缺失突變體的報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染用含

11、10％小牛血清的培液及含10％胎牛血清的培液培養(yǎng)的約50％-60％的前脂肪細(xì)胞，當(dāng)前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至接觸抑制兩天后，裂解細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)道基因活性，從而確定CHOP-10啟動(dòng)子上可能的胎牛血清反應(yīng)元件的位置。CH0P-10啟動(dòng)子的5’系列缺失突變體報(bào)道基因活性分析表明在-578bp到-321bp區(qū)域存在可能的FBS反應(yīng)元件，采用計(jì)算機(jī)分析軟件分析此區(qū)域含有對(duì)血清刺激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子SRF(Serumresponsefactor)和YYl(Yin

12、Yang1)的結(jié)合位點(diǎn)。GMSA表明SRF不能結(jié)合到CHOP-10啟動(dòng)子SRE(Serumresponseelement)位點(diǎn)上；YY1不僅能結(jié)合到此區(qū)域的YY1位點(diǎn)，也能結(jié)合到S旺位點(diǎn)，并且在胎牛血清培液培養(yǎng)的細(xì)胞與小牛血清培液培養(yǎng)的細(xì)胞中YYl結(jié)合到CHOP一10啟動(dòng)子上的能力存在差異。在胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞中，有更多YY1結(jié)合到CHOP—lO啟動(dòng)子上的Y¨或SRE位點(diǎn)上。盡管YYl具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制雙重功能，但在CHOP—10啟

13、動(dòng)子上結(jié)合的特點(diǎn)提示，YYl可能對(duì)CHOP—10啟動(dòng)子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能。YYl在CHOP一10啟動(dòng)子上結(jié)合的差異可能是導(dǎo)致胎牛血清培液培養(yǎng)的細(xì)胞與小牛血清培液培養(yǎng)的細(xì)胞中CHOP一10表達(dá)差異的原因，也是脂肪細(xì)胞分化早期，F(xiàn)BS引起CHOP一10表達(dá)下調(diào)的原因。 三、C／髓PB的磷酸化調(diào)節(jié) 我們深入研究了GSK3β對(duì)C／EBPβSer184和Thr179位點(diǎn)的磷酸化特征及與已知的C／EBPβThr188的MAPK磷酸化

14、位點(diǎn)之間的關(guān)系和磷酸化后對(duì)C／EBPβ的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄激活功能的影響。體外磷酸化實(shí)驗(yàn)及功能研究表明單獨(dú)的MAPK能使E.coli.中表達(dá)的野生型C／EBPβ蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，MS／MS結(jié)果表明磷酸化位點(diǎn)是C／EBPβThr188位的MAPK磷酸化位點(diǎn)，此時(shí)C／EBPβ的DNA結(jié)合活性仍很低。單獨(dú)的GSK3β不能使C／EBPβ發(fā)生磷酸化。當(dāng)MAPK與GSK3β共同作用時(shí)，C／EBPβ的磷酸化明顯增強(qiáng)，MS／MS結(jié)果表明C／EBPβ磷

15、酸化發(fā)生在Thr188位和Serl84位或Thr188位和Thr179位，為雙磷酸化位點(diǎn)，此時(shí)C／雎PB的D№結(jié)合活性明顯增強(qiáng)。說明GSK3B需要在姒PK對(duì)C／EBPβThr188位首先發(fā)生磷酸化后，才能使C／EBPβThr179和Serl84位點(diǎn)磷酸化。如果將Thr188，Thr179和Ser184位點(diǎn)均突變成丙氨酸，則MAPK和／或GSK3β均不能使突變的C／EBPβ蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，C／EBPβ也沒有DNA結(jié)合活性，進(jìn)一步說明C／

16、EBPβ發(fā)生系列磷酸化對(duì)于C／EBPβDNA結(jié)合活性的重要性。我們針對(duì)以上3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建了C／EBPβ的一系列突變體，以觀察高磷酸化的C／EBPβ是否具有更好的轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)果表明，隨著C／EBPβ突變成谷氨酸位點(diǎn)的增多(類似體內(nèi)磷酸化)，C／EBPβ對(duì)C／EBPα啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活功能增強(qiáng)，而隨著C／EBPβ突變成丙氨酸位點(diǎn)的增多(類似體內(nèi)去磷酸化)，C／EBPβ的轉(zhuǎn)錄激活功能降低。以上結(jié)果表明，C／EBPβThrl79和Serl84位