AMPK在氯離子介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用.pdf

1、目的：在調(diào)節(jié)心肌能量代謝過(guò)程中，AMPKα2起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)擬建立H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)及去除細(xì)胞外Cl-的A/R(Cl--freeA/R)損傷模型，探討AMPKα2低表達(dá)在氯離子介導(dǎo)心肌細(xì)胞A/R損傷中的作用，以便進(jìn)一步研究心肌A/R損傷機(jī)制。
　　 方法：運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，以pSuper.Retro為載體，構(gòu)建AMPKα2 shRNA重組質(zhì)粒。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，建立AMPKα2正常表達(dá)和低表達(dá)的心肌細(xì)胞(H

2、9c2)，Western Blot法測(cè)定AMPKα2的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分五組，每組重復(fù)6次：(1)正常對(duì)照組；(2)A/R組；(3)去除細(xì)胞外Cl-的A/R組(Cl--free A/R)；(4)pSuper+C1--free A/R組；(5)pS-AMPKα2+Cl--free A/R。四唑鹽(MTT)法測(cè)定各組心肌細(xì)胞存活率；測(cè)定各組抗氧化物酶SOD、乳酸脫氫酶LDH、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px的活性；流式細(xì)胞儀測(cè)定各組ROS水

3、平、線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞凋亡程度。
　　 結(jié)果：1.經(jīng)過(guò)酶切鑒定及基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)：AMPKα2 shRNA干擾質(zhì)粒重組成功；2.Western Blot檢測(cè)表明：重組質(zhì)粒能有效下調(diào)H9c2中AMPKα2蛋白表達(dá)；3.正常H9c2細(xì)胞經(jīng)A/R處理后損傷嚴(yán)重，去除細(xì)胞外Cl-的A/R組有明顯對(duì)抗A/R導(dǎo)致的細(xì)胞存活率、SOD、GSH-PX酶活性下降，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用；而AMPK低表達(dá)組中Cl--free對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用明顯消失，細(xì)胞

4、存活率、SOD、GSH-PX酶活性、線(xiàn)粒體膜電位下降，細(xì)胞內(nèi)ROS含量、LDH活性升高，細(xì)胞凋亡程度明顯比Cl--free A/R組嚴(yán)重(P<0.01)。pSuper+Cl--free A/R組與Cl--free A/R組相比，各指標(biāo)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：AMPKα2參與了去除細(xì)胞外氯離子(Cl--free)對(duì)抗心肌急性缺氧/復(fù)氧損傷的作用，AMPKα2基因沉默使Cl--free在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中的保護(hù)作