沙眼衣原體J型野生株ompA基因重組子的構(gòu)建.pdf

1、DNA疫苗是運用基因工程技術(shù),將編碼某種蛋白的外源基因與細(xì)菌質(zhì)粒構(gòu)建的重組體直接免疫機體,轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,使其表達保護性抗原,從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫的疫苗.該實驗的目的是構(gòu)建C.t主要外膜蛋白(MOMP)編碼基因ompA與pcDNA3質(zhì)粒的重組體ompA-pcDNA3,即C.t的DNA疫苗,希望能為C.t DNA疫苗的動物實驗研究提供材料.實驗中選用的真核表達載體為pcDNA3質(zhì)粒,目的基因為C.t的MOMP編碼基因ompA,使用的C

2、.t標(biāo)本來源于性傳播疾病門診患者的尿道及宮頸分泌物.標(biāo)本經(jīng)裂解處理后做為PCR擴增的模板,先用C.t種特異性引物擴增ompA基因,以此來篩選C.t陽性的臨床標(biāo)本;PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序,確定C.t臨床標(biāo)本的血清型;然后用帶限制性酶切位點的血清型特異性引物,PCR擴增此特定血清型的ompA基因;擴增的目的基因與載體經(jīng)酶切后,連接重組,轉(zhuǎn)化大腸桿菌;最后重組子經(jīng)抗生素平板篩選、PCR擴增篩選、酶切鑒定后,陽性重組子送測序公司,進行重組子的DN

3、A序列測定.實驗顯示:PCR擴增方法篩選C.t陽性的臨床標(biāo)本,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,擴增產(chǎn)物大小約1.2Kb,基因測序確定是C.t J血清型;PCR擴增J型C.t MOMP編碼基因ompA,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,擴增產(chǎn)物片段約1.0Kb,與預(yù)期的1022bp一致;PCR擴增方法篩選重組子ompA-pcDNA3,瓊脂糖凝膠電泳提示ompA基因存在于pcDNA3質(zhì)粒中;雙酶切法篩選重組子,酶切產(chǎn)生了5.4Kb和1.0Kb兩個片段,進