鴨圓環(huán)病毒Rep和ORF3蛋白部分生物學活性的研究.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)是單鏈環(huán)狀無囊膜DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的成員。研究表明DuCV感染主要引起鴨法氏囊淋巴細胞減少、萎縮、組織細胞增生等，前期進行的原位熒光檢測也表明DuCV感染鴨后在鴨的脾臟、胸腺和法氏囊中形成明顯的病灶，提示DuCV的致病作用可能與引起淋巴細胞的凋亡有關，這與PCV2的致病機理極為相似。前期我們驗證了DuCV的Cap蛋

2、白具有核定位信號，但其Rep蛋白是否具有核定位信號尚無定論，對于兩種基因型Rep蛋白的促細胞凋亡活性研究尚無人涉及。前期研究發(fā)現(xiàn)并證明了ORF3蛋白是具有凋亡活性的蛋白，但兩種基因型的ORF3蛋白促細胞凋亡活性是否存在差異尚需要試驗證實。
　　本研究主要進行了如下工作:
　　1.DuCV Rep蛋白核定位信號的研究
　　本研究通過cNLS Mapper軟件（http://nls-mapper.iab.keio.ac.j

3、p/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）在線分析發(fā)現(xiàn)Rep1具有兩個非典型的核定位信號，NLS1位于N端“10KRWVFTINNPTFEDYVHVLEFCTLDNCK37”， NLS2位于C端244ITSNKEPRDWYKSEFDLSALYRRINKYLVYN274，而在Rep2中只預測到了核定位信號NLS1。根據(jù)軟件分析的結果，分別構建了與RFP融合表達的野生型Rep1和Rep2表達質粒（Rep1-DsRed2、R

4、ep2-DsRed2）、NLS1缺失型表達質粒(Rep1ΔN10-37-DsRed2、Rep2ΔN10-37-DsRed2)、NLS2缺失型表達質粒（Rep1ΔN244-274-DsRed2、Rep2ΔN244-274-DsRed2）、NLS1和NLS2雙缺失表達質粒(Rep1ΔN10-37ΔN244-274-DsRed2、Rep1ΔN10-37ΔN244-274-DsRed2)。轉染H1299細胞48h后，通過在激光共聚焦顯微鏡下觀察

5、發(fā)現(xiàn)，C端NLS2的缺失沒有改變Rep1和Rep2的核定位能力，而NLS1缺失后，Rep1和Rep2分布于胞漿中，失去了胞核轉位的能力，從而證實了N端核定位信號是Rep進入細胞核所必須的。
　　2.DuCV Rep蛋白促細胞凋亡活性的研究
　　本研究通過構建兩組表達質粒，分別是帶flag標簽的兩個基因型Rep蛋白的表達質粒（p3×Flag-DuCV1-Rep、p3×Flag-DuCV2-Rep）和帶EGFP標簽的表達質粒（p

6、EGFP-DuCV1-Rep、pEGFP-DuCV2-Rep），分別使用FITC AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒、PE AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒和APO-DIRECT檢測試劑盒三種方法檢測Rep的凋亡活性。因為沒有合適的鴨源細胞系，考慮DuCV Rep蛋白在異源細胞系中的凋亡活性差異，分別在哺乳動物細胞系CHO和禽源細胞系DF-1上進行了Rep的凋亡活性分析。在凋亡檢測過程中，分別采取了只收取貼壁細胞、同時收取貼壁和上清細胞的兩種

7、樣品獲取方式，在轉染后24h、48h和72h三個時間點對樣品進行了Rep凋亡活性的多重方法交叉分析。研究結果表明，DuCV兩種基因型的Rep蛋白均存在一定的促細胞凋亡活性。在兩種不同來源的細胞系中，使用兩種不同的檢測方法和兩種不同收獲細胞樣品方式檢測，均顯示Rep1蛋白與對照組相比具有極顯著的促細胞凋亡活性;而Rep2蛋白與Rep1蛋白相比，促細胞凋亡活性要弱很多，并且在哺乳動物來源細胞系上導致細胞凋亡的效應相對滯后，顯示其蛋白凋亡活性

8、可能比較溫和。研究中還發(fā)現(xiàn)，禽源的DF-1細胞系對Rep2蛋白更敏感，更容易檢測到其具有的凋亡活性。
　　3.DuCV兩種基因型ORF3蛋白的凋亡活性差異檢測
　　本研究通過構建兩組表達質粒，分別是帶flag標簽的兩個基因型ORF蛋白的表達質粒（p3×Flag-DuCV1-ORF3、p3×Flag-DuCV2-ORF3）和帶EGFP標簽的表達質粒(pEGFP-DuCV1-ORF3、pEGFP-DuCV2-ORF3)，分別使用

9、FITC AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒、PE AnnexinⅤ凋亡檢測試劑盒和APO-DIRECT檢測試劑盒三種檢測方法，在哺乳動物細胞系CHO和禽源細胞系DF-1上進行了DuCV兩種基因型ORF3的凋亡活性分析。在凋亡檢測過程中，分別采取了只收取貼壁細胞、同時收取貼壁和上清細胞的兩種樣品獲取方式，在轉染后24h、48h和72h三個時間點對樣品進行了ORF3凋亡活性的多重方法交叉分析。研究結果表明，DuCV兩種基因型ORF3蛋白均存在

10、一定的促細胞凋亡活性，其中2型ORF3蛋白在轉染早期表現(xiàn)較為明顯的促細胞凋亡活性，并且隨著時間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;而1型ORF3蛋白發(fā)揮促細胞凋亡活性相對滯后，表現(xiàn)為隨著時間的推移逐漸上升的趨勢，并在轉染后期其細胞凋亡活性顯著高于2型ORF3。與禽源的細胞系DF-1相比，在哺乳動物細胞系CHO中，ORF3蛋白的促細胞凋亡活性發(fā)揮延遲，說明DuCV ORF3蛋白對不同的細胞系呈現(xiàn)不同的促細胞凋亡特點。
　　4.DuCV兩種

11、基因型ORF3蛋白和Rep蛋白致Caspase活性差異研究
　　Caspase的活化是凋亡的典型特征。本研究建立了檢測細胞凋亡相關基因（caspase3、caspase8和caspase9）mRNA的熒光定量RT-PCR方法。分別將表達DuCV兩種基因型ORF3蛋白的真核表達質粒轉染CHO細胞，在轉染后不同時間(24h、48h和72h)進行熒光定量PCR檢測，結果表明，兩種基因型DuCV ORF3蛋白轉染后會在不同時間引起細胞中c

12、aspase3和caspase8 mRNA表達水平的上調，但與對照組差異不顯著。分別將表達DuCV兩種基因型Rep蛋白和ORF3蛋白的真核表達質粒轉染CHO細胞，在轉染后不同時間(24h、48h和72h)使用caspase酶活性檢測試劑盒進行三種凋亡相關蛋白（caspase3、caspase8和caspase9）的檢測，結果顯示轉染后72h，Rep1組的Caspase3活性極顯著高于對照組和Rep2組(P＜0.01)，1型ORF3組的C