雜柑的遺傳多樣性與親緣關系研究.pdf

1、本研究采用RAPD技術對來源于中國柑桔研究所和成都蒲江兩地的19個優(yōu)良雜柑栽培品種進行遺傳分析，并選取9個來源于中國柑桔研究所的柑橘屬及近緣屬其他品種為對照，以期為雜柑種質(zhì)資源收集、保存、鑒定、評價、分類以及親緣關系研究提供參考方法和理論依據(jù)。同時研究川渝不同栽培地區(qū)優(yōu)良雜柑‘不知火’的遺傳背景及遺傳差異，以期為川渝‘不知火’栽培品種真實性及防止‘不知火’遺傳變異提供科學依據(jù)。結(jié)果如下： 1.通過核酸沉淀外觀觀察、紫外分光光度分

2、析、凝膠電泳檢測和RAPD-PCR擴增反應對柑橘基因組DNA提取的五種方法比較，認為SDS法、核DNA法、CTAB法和適合微生物DNA提取的微波法均能有效提取柑橘基因組，而改良微波法不能有效提取柑橘基因組。從PCR擴增結(jié)果看，又以微波法提取的雜柑DNA質(zhì)量較高，是完全可以進行RAPD擴增，并且較其他方法耗時短、效率高，因此，適合微生物DNA基因組的提取方法(微波法)更適合柑橘基因組的提取。 2.采用常規(guī)的單因素試驗設計法對雜柑R

3、APD-PCR反應的主要成份和參數(shù)進行多次優(yōu)化，適合雜柑RAPD擴增的最佳反應體系為：20μL反應體系中含模板DNA25ng，10×buffer2μl，Mg2+2.0mmol/L，引物0.5μmol/L，dNTPs0.22mmol/L，TaqDNA聚合酶1.4U。反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，43個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min，4℃保溫。 3.以果實性狀差異較大的

4、五份材料‘不知火’、‘星路比’、‘朋娜’、晚白柚和枳為試材，在100條RAPD隨機引物中篩選出16條擴增效果較好的引物。16條引物共擴增出270條RAPD位點，平均每個引物16.25個位點，DNA片段大小為200-4500bp，其中有254條帶具有遺傳多態(tài)性，約占總數(shù)的94.07％；每個引物檢測到的RAPD多態(tài)譜帶不等，從7條到22條，平均15.875條。這表明雜柑種質(zhì)個體間的DNA多態(tài)性是豐富的，因此，采用RAPD標記完全能從DNA水

5、平上檢測到這些種質(zhì)柑橘材料間的差異。 4.19個雜柑材料被成功區(qū)分為兩類，其中10份雜柑(‘天草’、‘不知火’、‘清峰’、‘津之香’、‘陽香’‘默科特’、‘諾瓦’、‘日輝’、‘愛媛14號’)被聚為寬皮柑橘類，9份雜柑(‘有明’、‘明尼奧拉’、‘星路比’葡萄柚、‘火焰’葡萄柚、‘紅肉’葡萄柚、‘黃果柑’、‘勝山伊予柑’、‘宮內(nèi)伊予柑’、‘卡里佐’)和橙類柚類聚為另一類。都未被聚為枳類。 5.在16個RAPD引物在28個雜柑

6、及對照柑桔屬及近緣屬品種中檢測到只存在與枳及枳的后代中的一條特異性條帶，該條帶由引物104(GTGACGTAGG)擴增出來，為1519bp。在后來的進一步試驗中證實了這條特異性帶僅存在枳及其雜種中，目前已對其進行成功測序，國內(nèi)外未見報道，其功能還有待進一步研究。 6.對川渝不同地區(qū)栽培的‘不知火’的RAPD-PCR擴增結(jié)果表明不同渠道引進的‘不知火’分為兩大類，從中國柑橘研究所引種的聚為一類，從華中農(nóng)業(yè)大學引種的則聚為另一類。