表達(dá)FMDV vp1基因和山羊γ-干擾素基因的重組山羊痘病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、口蹄疫(FootandmouthDisease，F(xiàn)MD)和羊痘(Capripox)均被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為極其重要傳染病，雖然山羊和綿羊不如牛和豬易感，但是山羊和綿羊感染口蹄疫病毒后會(huì)長期帶毒，成為隱性帶毒者，這給該病的防制增加了難度。 目前，在多數(shù)國家，滅活苗仍然是防制口蹄疫的主要方法，但是往往滅活過程中會(huì)存在滅活不全而可能引起散毒，而且滅活苗引起的免疫保護(hù)期不夠持久。重組基因工程疫苗雖然更安全，更經(jīng)濟(jì)，但是往往不能產(chǎn)生對機(jī)體

2、的完全保護(hù)，因此有必要開發(fā)各種免疫佐劑來增強(qiáng)疫苗的免疫效果。雖然目前已經(jīng)有很多商品化佐劑如佛氏完全佐劑、鋁鹽佐劑、免疫刺激復(fù)合物佐劑等，但它們都受到自身的毒性及免疫副作用的限制。最近，佐劑的概念已經(jīng)擴(kuò)展為以重組細(xì)胞因子與新開發(fā)疫苗聯(lián)合免疫，這種細(xì)胞因子類佐劑被稱為分子佐劑。 干擾素-γ(Interferongamma，INF-γ)又稱Ⅱ型干擾素，是一種由活化的NK細(xì)胞和CD4+、CD8-等T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它顯示出低特異

3、性的抗病毒活性，而具有更明顯的免疫調(diào)節(jié)活性。因此，干擾素-γ可作為免疫佐劑與一些病原微生物的保護(hù)性抗原基因共同表達(dá)，從而加強(qiáng)和改善疫苗的免疫效果。 以痘病毒作載體表達(dá)病原微生物的保護(hù)性抗原基因的重組痘病毒活載體疫苗不但能夠起到一種疫苗同時(shí)防制兩種疾病的作用，而且一般比滅活疫苗引起的免疫力更為持久，但也有其不足，表達(dá)的口蹄疫病毒蛋白不能引起對機(jī)體的完全保護(hù)，這也是目前在痘病毒活載體疫苗應(yīng)用過程中有待解決的問題。利用干擾素-γ免疫佐

4、劑效應(yīng)，構(gòu)建以山羊痘病毒作載體共表達(dá)口蹄疫病毒蛋白和山羊干擾素-γ的重組痘病毒活載體疫苗可能能為解決上述問題提供新的方法和思路。 首先，我們應(yīng)用RT-PCR方法從山羊外周血淋巴細(xì)胞中克隆了山羊(Caprine)IFN-γ基因，將其克隆、鑒定及DNA測序分析，測序結(jié)果顯示克隆的IFN-γ基因全長501個(gè)核苷酸，編碼166個(gè)氨基酸。經(jīng)SignalP3.0分析表明，前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列：將去除信號(hào)肽的IFN-γ基因插入到原核表達(dá)

5、載體pET-30a(+)上，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-CapIFN-γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌中以包涵體形式融合表達(dá)。用ProBondTM蛋白純化試劑盒純化，用所獲得的重組蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)三次背部皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔，制備了兔抗山羊IFN-γ多克隆血清。經(jīng)WesternBlotting鑒定，多克隆抗血清可與純化的山羊重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，說明重組蛋白具有

6、抗原活性，為我們進(jìn)一步研究它們的免疫治療作用和免疫佐劑作用奠定了基礎(chǔ)。 在本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了表達(dá)LacZ的重組病毒rGPV-LacZ之后，以O(shè)型FMDV-vp1基因和山羊IFN-γ基因作為構(gòu)建重組病毒的靶抗原構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體PFK-VP-IFNγ，以rGPV-LacZ為親本毒株，反向蝕斑篩選以除去LacZ基因，獲得了共表達(dá)vp1基因和山羊IFN-γ基因的重組病毒rGPV-VP1-IFNγ。經(jīng)過連續(xù)6輪反向蝕斑篩選、純化，經(jīng)PCR

7、鑒定獲得了一株重組病毒rGPV-VP1-IFNγ。對vp1基因和山羊IFN-γ基因PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測序驗(yàn)證。經(jīng)間接免疫熒光和WesternBlotting以及生長動(dòng)力學(xué)檢測，rGPV-VP1-IFNγ感染的細(xì)胞用FMDV特異性抗體及制備的羊抗兔多克隆血清可以檢測到rGPV-VP1-IFNγ感染的細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光。而且重組病毒中表答的VP1蛋白能夠與制備的羊抗兔多克隆血清反應(yīng)。 用VSV法檢測IFN-γ活性，結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)上清能抑制V

8、SV產(chǎn)生的細(xì)胞病變，其中IFN-γ的效價(jià)為160-320U/mL。與疫苗株比較，二者增殖特性無明顯著異，在BT細(xì)胞上形成的蝕斑火小和形態(tài)相同。將rGPV-VP1-IFNγ在BT細(xì)胞上連續(xù)傳12代，并對VP1基因和山羊IFN-γ基因進(jìn)行PCR檢測、病毒滴度測定。 結(jié)果表明，vp1基因和山羊IFN-γ叫基因穩(wěn)定表達(dá)，rGPV-VP1-IFNγ在BT細(xì)胞上的病毒滴度和細(xì)胞病變與rGPV-LacZ、GPV-AV41無明顯差異，表明Vp1