MicroRNAs在乳腺癌和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育異常中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類進(jìn)化上保守的、在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNAs。MiRNAs的一個關(guān)鍵作用是通過堿基不完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA的3'非翻譯端(3'-untranslated Region，3'-UTR)的特定區(qū)域相互作用來抑制靶基因的表達(dá)。生物體內(nèi)約1/3的編碼蛋白受miRNAs的調(diào)節(jié)，而每個miRNA估計(jì)有大約上百個靶基因。由于miRNA在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演的重要的角色，使其在生命體的生長

2、發(fā)育、細(xì)胞的分化和凋亡以及人類疾病的發(fā)生等生命過程中起著重要的作用。研究miRNAs在疾病中的表達(dá)模式和作用機(jī)制可能為疾病的診斷和治療提供新的標(biāo)志物。
　　 一、miR-101和miR-185在乳腺癌發(fā)生中的分子作用機(jī)制
　　 近年來，越來越多的數(shù)據(jù)表明，miRNAs的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。miRNAs在許多類型的癌癥中存在著異常的表達(dá)圖譜，如肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸癌等，提示

3、了miRNAs可能扮演癌癥基因或抑癌基因的角色。我們實(shí)驗(yàn)室曾利用候選基因篩查的方法以人乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織為研究對象篩選在乳腺癌發(fā)生中差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-101和miR-185存在差異表達(dá)。我們分別研究了它們在乳腺癌發(fā)生中的作用。
　　 我們發(fā)現(xiàn)了miR-101在三陰、三陽、ER/PR陰性和HER2陽性以及ER/PR陽性和HER2陰性的乳腺癌樣本中，發(fā)生了顯著的下調(diào)。miR-101表達(dá)上調(diào)后，能夠抑制乳腺

4、細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;而表達(dá)下調(diào)后，對細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生相反的影響。進(jìn)一步的研究表明，miR-101和Stathmin1(Stmn1)的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)。miR-101能夠結(jié)合在Stmn1的3'-UTR進(jìn)而抑制其翻譯。miR-101表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致對細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，可以通過Stmn1的過表達(dá)而部分恢復(fù)。Stmn1的敲除減弱了miR-101介導(dǎo)的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)效應(yīng)。另外，體內(nèi)的研究表明，與miR-1

5、01的普遍下調(diào)相比，Stmn1 mRNA和蛋白水平在不同類型的人乳腺癌組織中發(fā)生了顯著的上調(diào)。
　　 miR-185在三陰、三陽、ER/PR陰性和HER2陽性的乳腺癌樣本中，發(fā)生了明顯的下調(diào)。而在ER/PR陽性和HER2陰性的乳腺癌中，發(fā)生了略微的下調(diào)。我們通過在miR-185表達(dá)相對較低的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-453中過表達(dá)miR-185，而在表達(dá)相對較高的乳腺癌細(xì)胞MCF7和T47D中敲低miR-18

6、5來研究miR-185在乳腺癌中的作用。結(jié)果表明了miR-185表達(dá)上調(diào)能夠抑制細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，反之亦然。同時，我們還驗(yàn)證了血管內(nèi)皮生長因子a(vascular endothelial growth factor a，Vegfa)是miR-185的靶基因之一。Vegfa的過表達(dá)可以部分恢復(fù)由于miR-185表達(dá)的上調(diào)對細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用;而Vegfa的敲除減弱了miR-185介導(dǎo)的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)效應(yīng)

7、。此外，Vegfa mRNA和蛋白水平在三陰、三陽、ER/PR陰性和HER2陽性的乳腺癌樣本中，發(fā)生了顯著的上調(diào)。
　　 綜上所述，miR-101和miR-185在不同類型人乳腺癌組織中的表達(dá)下調(diào)，對乳腺癌細(xì)胞存在相似的調(diào)節(jié)作用，與它們通過各自的靶基因增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和浸潤能力有密切聯(lián)系，可能為未來臨床上對乳腺癌的診斷提供很有價(jià)值的線索。
　　 二.miR-206在神經(jīng)細(xì)胞異常發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制
　　 MiR

8、-206是miRNAs家族成員之一。miR-206在骨骼肌的生長和發(fā)育中起著重要的作用，。然而，miR-206是否在其他細(xì)胞中發(fā)揮功能仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，通過對sodium arsenite(SA)處理引起的神經(jīng)管畸形的雞胚進(jìn)行microRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)了miR-206存在差異表達(dá)。由此，我們推測miR-206可能在神經(jīng)細(xì)胞異常發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。本研究通過Northern blot分析進(jìn)一步驗(yàn)證了，SA處理的雞胚中

9、miR-206發(fā)生了差異表達(dá)。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U343和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH中過表達(dá)miR-206后，通過MTT、Edu Apollo assay和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞存活能力發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-206抑制細(xì)胞增殖，而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡;反之亦然。利用生物信息學(xué)預(yù)測顯示orthodenticle homeobox2(Otx2)是miR-206的靶基因。我們將Otx2的3'-UTR與miR-206的模擬物或抑制物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過雙

10、熒光素酶活性分析進(jìn)一步驗(yàn)證Otx2和miR-206的關(guān)系，結(jié)果顯示熒光素酶活性伴隨著miR-206的過表達(dá)而顯著減弱，伴隨著miR-206的敲低而明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果提示了miR-206能與Otx2的3'-UTR相互作用， Otx2可能是miR-206的靶基因。通過western blot和qRT-PCR分析miR-206對內(nèi)源性O(shè)tx2表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，miR-206過表達(dá)能夠下調(diào)Otx2的表達(dá)，而miR-206的低表達(dá)能夠提高Otx2的