豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，病毒粒子直徑約17nm，無囊膜，二十面體對稱，基因組由單股閉合環(huán)狀DNA構(gòu)成。PCV2被證明是近年來發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原，并與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征、母豬繁殖障礙等相關(guān)疾病有關(guān)。該

2、病最早于1991年在加拿大被發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、皮膚蒼白及黃疸等，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了對臨床PCV2抗體進(jìn)行檢測及對PCV2進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。本研究利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組PCV2-Cap蛋白，經(jīng)過Ni2+親和層析柱純化帶有His-Tag標(biāo)簽的重組蛋白，用純化的重組蛋白作為包被抗原，建立了一種間接ELISA診斷方法，用于臨床PCV2感染豬或疫苗免疫豬血清抗體的檢測。 P

3、CV2-Cap蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與免疫活性鑒定：利用業(yè)已構(gòu)建的重組桿狀病毒表達(dá)PCV2-Cap蛋白基因的種毒(rBac/PCV2-Cap)，接種昆蟲細(xì)胞株(Sf-21)，對重組蛋白表達(dá)參數(shù)及純化工藝進(jìn)行了研究。PCV2-Cap蛋白表達(dá)量占總蛋白的18.7％左右。利用重組蛋白C末端設(shè)計的His-tag與Ni2+的螯合作用原理，采用Ni2+親和層析柱純化獲得重組蛋白的純度為90.1％，濃度為593μg/mL。SDS-PAGE與Weste

4、rn-blot分析證實(shí)，該重組蛋白可被PCV2特異性抗體所識別，具有良好的免疫活性，可作為ELISA檢測的包被抗原。 檢測PCV2抗體的間接ELISA方法的建立：以純化的重組PCV2-Cap蛋白作為包被抗原，建立了一種間接ELISA抗體檢測方法。通過試驗(yàn)確定了最適反應(yīng)條件，抗原最適包被濃度為2.965μg/mL，包被時間為37℃1h后4℃過夜，封閉液為1％BSA-PBST，作用時間為37℃1h，血清最適稀釋度為1:100，作用時

5、間為1h，酶標(biāo)抗體最適稀釋濃度為1:4000，作用時間為1h，最佳顯色底物為ABTS，顯色時間為37℃30min。判定標(biāo)準(zhǔn)為OD405nm≥0.343者判為抗體陽性，OD405nm≤0.281者判為抗體陰性，介于兩者之間為可疑。用ELISA與IPMA兩種方法對150份血清進(jìn)行平行檢測，符合率為95.3％(143/150)；該方法的特異性為91.2％(31/34)，敏感性為96.5％(112/116)；與其他幾種常見豬病毒參考血清無交叉反

6、應(yīng)。剛該檢測方法對PCV2人工感染豬血清檢測結(jié)果，病毒接種后第5周抗體陽轉(zhuǎn)，第8～9周抗體水平達(dá)到高峰。 PCV2抗體檢測試劑盒的組裝及應(yīng)用：在建立的ELISA方法的基礎(chǔ)上，對抗原反應(yīng)板制備工藝，酶標(biāo)二抗、陽性血清、陰性血清和試劑盒的保存條件進(jìn)行了試驗(yàn)，并組裝成ELISA抗體檢測試劑盒。對試劑盒的批內(nèi)、批間變異系數(shù)檢測分別為4.0％～4.8％和8.9％～9.9％：試劑盒置-20℃保存12個月穩(wěn)定。用該試劑盒對來自黑龍江、吉林、河