EGCG經(jīng)AKT1通路誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：白血病是我國兒童最常見的惡性腫瘤之一，臨床化療藥物的不斷改進使白血病治療取得了飛速進展，但仍有許多化療藥物毒副作用很強，致使部分患者因不能耐受而放棄治療。本研究旨在探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）體外誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡及其機制，為臨床開發(fā)新的抗白血病藥物提供實驗資料和理論依據(jù)。
　　方法：首先采用MTT法檢測EGCG抑制HL-60細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50值）；其次通過繪制細(xì)胞生長曲線和軟瓊脂集落形成

2、實驗觀察EGCG抑制HL-60細(xì)胞的增殖情況；然后利用吖啶橙（AO）染色、流式細(xì)胞術(shù)及 DNA凝膠電泳法檢測EGCG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡情況；同時采用實時熒光定量RT-PCR和Western-blot檢測EGCG處理后HL-60細(xì)胞中AKT1基因和蛋白的表達，最后分析AKT1蛋白的磷酸化水平與Caspase-3蛋白活化的情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示：EGCG抑制HL-60細(xì)胞增殖的IC50值為58.70mg

3、·L-1。
　　2.細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示：隨著 EGCG濃度增加，處理時間延長，對 HL-60細(xì)胞生長抑制作用不斷增加，且呈濃度依賴性。
　　3.軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示：隨著 EGCG處理濃度的增加，HL-60細(xì)胞形成的集落體積逐漸變小，集落數(shù)目減少，呈濃度依賴性抑制集落的形成。
　　4.吖啶橙（AO）染色結(jié)果顯示：EGCG處理HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)桔紅色或紅色核固縮、核邊集和核碎裂等典型凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，隨

4、著 EGCG濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目不斷增多。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：隨著EGCG濃度的升高，HL-60細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，其呈濃度依賴性誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡。
　　6. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示：EGCG處理HL-60細(xì)胞后，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見DNA梯形條帶，且隨著濃度升高，梯形條帶越明顯。
　　7.實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：隨著EGCG濃度的升高，AKT1基因表達逐漸降低，呈濃度

5、依賴性抑制AKT1基因的表達。
　　8. Western-blott檢測結(jié)果顯示：隨著EGCG濃度的升高，HL-60細(xì)胞中AKT1蛋白的表達逐漸降低，呈濃度依賴性抑制AKT1蛋白的表達。
　　9.磷酸化AKT1蛋白和活化Caspase-3蛋白的Western-blot檢測結(jié)果顯示，HL-60細(xì)胞中 AKT1蛋白的磷酸化水平隨著EGCG濃度增加逐漸降低，而Cleaved Caspase-3蛋白量卻隨著EGCG濃度增加逐漸升高。