單核細胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA檢測方法的建立.pdf

1、李斯特菌屬(Listeriaspp.)是一類革蘭氏陽性菌，屬內(nèi)包括單核細胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)、綿羊李斯特菌(L.ivanovii)、英諾克李斯特菌(L.innocua)、威爾斯李斯特菌(L.welshimeri)、西爾李斯特菌(L.seelieri)和格氏李斯特菌(L。grayi.)等6個種。李斯特菌在自然界中廣泛存在，其中單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)對人和多種

2、動物具有致病性，在國內(nèi)外食品安全檢測與控制中日益受到重視。LM在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。同時，單核細胞增多李斯特菌作為研究胞內(nèi)菌感染和細胞免疫的良好模型，已經(jīng)引起越來越多研究者的關(guān)注。目前，國內(nèi)對LM的研究尚不深入，工作實踐中使用的檢驗方法也主要采用二次增菌后分離鑒定，煩瑣、費時，迫切需要建立敏感、特異、高通量的分子生物學(xué)檢測方法。在LM中存在兩個主要的毒力島，即LIPI-1毒力島(Liste

3、riapathogenicityisland1)和LIPI-2(Listeriapathogenicityisland2)，其中，IPIL-1也稱為prfA基因簇，是主要毒力因素，由prfA，plcA、hly、mpl，actA和plcB構(gòu)成，由prfA進行表達調(diào)控。本研究旨在對食品中單核細胞增多性李斯特菌污染狀況、LM的生物學(xué)特性、LIPI-1毒力島全基因序列以及分子生物學(xué)檢測方法進行研究，為系統(tǒng)開展LM致病機理研究、開發(fā)新型疫苗載體等

4、工作奠定基礎(chǔ)，為檢驗檢疫工作提供檢測技術(shù)支持，為開展食品中LM的防控提供依據(jù)。 1.單核細胞增多性李斯特菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究 按照檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T0148.1-2005)對156個動物源性食品樣品進行了LM的分離鑒定，從中分離到7株單核細胞增多性李斯特菌，表明在動物源性食品中存在LM污染，該結(jié)果將為進行食品中LM的風(fēng)險評估等工作提供參考依據(jù)。以參考菌株CCTCCAB97021和C53004為參照，對LM

5、分離菌株XFL0605進行了藥敏試驗、小鼠致病性試驗(LD50測定)和溶血活性檢測。在溶血素(LLO)溶血活性實驗中，相同培養(yǎng)條件下，3個試驗菌株培養(yǎng)上清中LLO的含量存在差異，但產(chǎn)生的單位濃度LLO活性相當(dāng)，推測菌株XFL0605產(chǎn)生LLO的能力較參考菌株CCTCCAB97021和C530042株LM菌株弱。分離菌株XFL0605培養(yǎng)上清溶血活性與其它試驗菌株相當(dāng)，但小鼠毒力(LD50)方面較其它實驗菌株略低，該菌對昆明鼠的LD50為

6、2.58×105CFU/mL，推測該菌株致病性差異可能由于LLO等相關(guān)毒力因子的表達差異所致。試驗結(jié)果還證明，溶血素在pH5.6時活性最高，在pH7.0時活性基本喪失。對實驗菌株的藥敏實驗結(jié)果表明，分離菌株XFL0605對常用藥物(氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星)敏感性較高，為在分子生物學(xué)改造研究中，選擇抗性篩選標(biāo)記提供了依據(jù)。 為方便、精確的檢測溶血素活性，建立了分光光度法檢測LM溶血素(LLO)活性

7、，本方法中綿羊紅細胞(SRBC)濃度與A540相關(guān)系數(shù)為0.99995，表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，能夠直接對LLO溶血活性進行量化分析。分離菌株XFL0605、2個參考菌株C53004和CCTCCAB97021培養(yǎng)上清半數(shù)溶血值(HC50)測定結(jié)果分別是18.85、19.68和21.38，與測定的LLO含量(分別為1.305、1.530和1.749mg/mL)的呈正相關(guān)性，表明3個LM菌株產(chǎn)生的單位含量LLO溶血活性相當(dāng)，該結(jié)論在對3個菌株

8、hlyA基因克隆測序后得到印證。本研究建立的分光光度法檢測LM溶血素活性的方法具有相關(guān)系數(shù)高、敏感和判定客觀的特點，較好的解決了菌株LLO溶血活性檢測與鑒定問題，為進一步測定單核細胞增多性李斯特菌溶血素(LLO)編碼基因表達產(chǎn)物活性檢測奠定基礎(chǔ)。同時，本研究還改進和建立了微量反應(yīng)板梯度稀釋法檢測溶血素的方法，該方法直觀、操作方便。 2.單核細胞增多性李斯特菌分子生物學(xué)檢測方法研究 針對LM的hlyA基因設(shè)計特異性引物和探

9、針，PCR擴增目的片段長度為348bp，建立了PCR和PCR-ELISA.檢測食品樣品中單核細胞增多性李斯特菌的方法。本研究建立的PCR-ELISA方法中，在上游引物5’端標(biāo)記生物素，核酸探針的3’端標(biāo)記地高辛，將PCR擴增、核酸液相雜交以及酶聯(lián)顯色技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)擴增產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素與包被在微孔板上的鏈霉親和素結(jié)合，標(biāo)記有地高辛的探針與產(chǎn)物雜交，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯色。經(jīng)對試驗菌株檢測表明，PCR、PCR-E

10、LISA方法檢測單核細胞增多性李斯特菌能擴增出特異片段，其它李斯特屬的綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、西爾李斯特菌和格氏李斯特菌、大腸桿菌、葡萄球菌和沙門氏菌等擴增檢測結(jié)果是陰性。對相關(guān)條件進行了優(yōu)化，當(dāng)NaOH濃度為0.3mol/L，雜交時間60min，酶反應(yīng)時間為45min時，結(jié)果較好，洗板液以pH7.4TBS-T為最佳。與PCR產(chǎn)物電泳法檢測比較，PCR-ELISA的敏感性是前者156倍以上，并適合批量樣品的檢測分析

11、。對60個樣品檢測表明，與SN/T0148.1-2005方法(引用ISO11290-1:2004)相比，PCR和PCR-ELISA方法具有更高的敏感性，表明本方法可以用于肉類食品中單核細胞增多性李斯特菌的快速診斷，具有敏感、特異、快速，重復(fù)性良好，無溴乙錠污染以及適合批量檢測等優(yōu)點，進一步標(biāo)準(zhǔn)化后可望作為食品中單核細胞增多性李斯特菌的常規(guī)檢測方法。 3.單核細胞增多性李斯特菌IPIL-1全基因克隆與序列分析 參考Genb

12、ank中的單核細胞增多性李斯特菌LIPI-1有關(guān)基因序列設(shè)計引物，分段擴增，再進行編碼核苷酸序列拼接，克隆了單核細胞增多性李斯特菌分離菌株XFL0605LIPI-1毒力島全基因，序列全長為8558bp，AccessionNo.EF661572，包括了完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB等6個基因。 對單核細胞增多性李斯特菌XFL0605株LIPI-1編碼的6個毒力基因核苷酸序列進行分析表明，各毒力基因反映

13、出來的進化關(guān)系不盡一致，表明該菌株在獲得LIPI-1外源性毒力基因方面具有不同步性，各毒力基因的來源也不盡相同。對XFL0605菌株中LIPI-1各毒力基因所推導(dǎo)氨基酸序列N端作信號肽預(yù)測分析結(jié)果表明，PlcA、LLO、Mpl、ActA和PlcB5個毒力蛋白中均存在信號肽序列；actA基因推導(dǎo)氨基酸序列中存在跨膜區(qū)(578-600位編碼氨基酸)，其跨膜蛋白為I型。LIPI-1序列中存在5個14bp的PrfA蛋白結(jié)合區(qū)，分別位于plcA上

14、游59-73bp處，prfA上游62-75bp處，hlyA基因的上游183-196bp處，mpl上游185-198bp和actA基因上游185-198bp處。這些核苷酸序列是調(diào)控蛋白PrfA的結(jié)合位點，并具有回文結(jié)構(gòu)的特點。 對3個菌株(XFL0605、C53004和CCTCCAB97021)hlyA基因和推導(dǎo)氨基酸序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)三者具有高度同源性，hly基因同源性在96.9％-100％之間，氨基酸同源性在97.9％以上，

15、并具有相同的PEST基序和C端保守11肽序列，表明所測定3個菌株培養(yǎng)上清中LLO活性基本相當(dāng)具有遺傳基礎(chǔ)。對克隆的hlyA基因所推導(dǎo)溶血素氨基酸序列進行PEST分析結(jié)果表明，編碼LLO的N端32-50位氨基酸序列(KENSISSMAPPASPPASPK)為富含P(脯氨酸)、E(谷氨酸)、S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)的PEST(Pro-Glu-Ser-Thr)基序，PESTfind值為4.71。試驗菌株XFL0605actA基因編碼604個