小麥漸滲系耐鹽抗旱的蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究.pdf

1、近年來(lái)，由于環(huán)境變化加劇，對(duì)世界范圍內(nèi)的作物生長(zhǎng)帶來(lái)了巨大的影響.據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)，適于耕種的土地不足10％，大部分土地處于干旱、鹽漬、沼澤、冷土等逆境中。因而對(duì)植物鹽、旱脅迫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行深入研究，培育耐鹽、抗旱作物新品種，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一項(xiàng)重要任務(wù)。 本實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)不對(duì)稱(chēng)體細(xì)胞雜交方法成功育成世界首例體細(xì)胞雜種耐鹽、抗旱、高產(chǎn)小麥新品種山融3號(hào)，該品種為含有少量供體親本高冰草遺傳物質(zhì)的小麥漸滲系。本試驗(yàn)通過(guò)雙向電泳(2-DE

2、)方法獲得了山融3號(hào)及其親本普通小麥濟(jì)南177幼苗根和葉的鹽、旱脅迫差異蛋白質(zhì)組圖譜，并利用質(zhì)譜(MALTI-TOF-TOF MS)技術(shù)鑒定了差異表達(dá)蛋白質(zhì)，再采用RT-PCR方法分析這些差異表達(dá)蛋白編碼序列的表達(dá)方式，從蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平上系統(tǒng)分析了雜種及其親本小麥不同組織器官對(duì)鹽、旱脅迫的應(yīng)答特征，探討了山融3號(hào)可能的耐鹽、抗旱機(jī)制。 1.在濟(jì)南177與山融3號(hào)幼苗根中發(fā)現(xiàn)了93個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并通過(guò)MS鑒定了88個(gè)。首

3、先，山融3號(hào)與濟(jì)南177根蛋白質(zhì)組本身具有差異。在山融3號(hào)和濟(jì)南177根中特異表達(dá)的蛋白分別有13個(gè)和21個(gè)。其次，山融3號(hào)和濟(jì)南177中的鹽、旱脅迫誘導(dǎo)蛋白存在顯著差異，在鑒定的20個(gè)鹽、旱誘導(dǎo)型蛋白中，3個(gè)在山融3號(hào)中被特異誘導(dǎo)，5個(gè)在濟(jì)南177中被特異誘導(dǎo)，其余12個(gè)在濟(jì)南177與山融3號(hào)均被誘導(dǎo)；第三，鹽、早脅迫響應(yīng)蛋白在鹽、旱脅迫下的表達(dá)模式有較大差異。鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)和下調(diào)的蛋白數(shù)量分別比旱脅迫增加19.2％和11.7％，表明

4、鹽脅迫可能引起細(xì)胞更劇烈更廣泛的脅迫應(yīng)答過(guò)程和更多脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá)變化。而另外一些蛋白如醌還原酶(根90)與翻譯起始因子5A3(根74)在濟(jì)南177根中旱脅迫下表達(dá)下調(diào)而鹽脅迫下被抑制，則表明鹽脅迫與早脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和效應(yīng)特征存在一定的差異。第四，根中鹽、旱脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá)模式具有品種差異，表現(xiàn)為同種蛋白在濟(jì)南177與山融3號(hào)根中的表達(dá)模式不同。如核苷切除修復(fù)蛋白(根21)在鹽、旱脅迫下濟(jì)南177根中表達(dá)下調(diào)而山融3號(hào)根中表達(dá)不變，

5、醛縮酶(根8)在旱脅迫下濟(jì)南177根中表達(dá)不變而山融3號(hào)根中表達(dá)上調(diào)，鹽脅迫下根74在濟(jì)南177根中的表達(dá)被抑止而在山融3號(hào)根中的表達(dá)下調(diào)。表明體細(xì)胞雜交改變了脅迫響應(yīng)蛋白對(duì)鹽、早脅迫的應(yīng)答模式。 2.在濟(jì)南177與山融3號(hào)葉中發(fā)現(xiàn)了65個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并通過(guò)MS鑒定了63個(gè)。比較分析顯示，它們表現(xiàn)出與根中相似的各種差異。例如：葉中鹽、旱脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá)模式也有較大差別：葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP24前體(葉1)在山融3號(hào)葉中旱脅迫下

6、表達(dá)上調(diào)12.7倍而鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)6.1倍，過(guò)氧化氫酶(葉23)在濟(jì)南177葉中鹽脅迫下表達(dá)被抑止；超氧化物歧化酶(葉51)在濟(jì)南177葉中旱脅迫下表達(dá)上調(diào)而鹽脅迫下表達(dá)不變，這些差異反應(yīng)了鹽與旱脅迫信號(hào)途徑調(diào)節(jié)機(jī)制的差異。而葉中鹽、旱脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá)模式也具有品種差異：如葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP24前體(葉1)在鹽、旱脅迫下濟(jì)南177葉中表達(dá)下調(diào)而在山融3號(hào)的葉中表達(dá)上調(diào)，2一半胱氨酸氧還蛋白類(lèi)似蛋白(葉21)在旱脅迫下的濟(jì)南17

7、7葉中表達(dá)不變而在山融3號(hào)葉中表達(dá)上調(diào)，鹽脅迫下過(guò)氧化氫酶(葉23)在濟(jì)南177葉中表達(dá)被抑止而山融3號(hào)葉中表達(dá)上調(diào)。但是，山融3號(hào)與濟(jì)南177葉蛋白質(zhì)組間的差異沒(méi)有根蛋白質(zhì)組間明顯；山融3號(hào)和濟(jì)南177葉中鹽、旱脅迫誘導(dǎo)蛋白差異也比根中小，在發(fā)現(xiàn)的14個(gè)鹽、旱誘導(dǎo)型蛋白中，只有1個(gè)是山融3號(hào)特異性的鹽脅迫誘導(dǎo)型蛋白，其余13個(gè)在濟(jì)南177與山融3號(hào)中均被鹽、旱誘導(dǎo)。 3.對(duì)28個(gè)蛋白(包括25個(gè)差異表達(dá)蛋白和三個(gè)已知的鹽脅迫密

8、切相關(guān)蛋白SOS1/2/3)進(jìn)行RT-PCR檢驗(yàn)，結(jié)果表明：第一，11個(gè)蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄本在各處理之間沒(méi)有顯著差異，其余17個(gè)在各處理間表現(xiàn)出不同的差異表達(dá)特征。這表明基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程，脅迫響應(yīng)蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)特征沒(méi)有直接相關(guān)性，其表達(dá)在不同水平上受到多樣而立體的調(diào)控。第二，在轉(zhuǎn)錄水平上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)以上根與葉蛋白質(zhì)組中的品種特異性表達(dá)蛋白，也就是說(shuō)，沒(méi)有一個(gè)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平是品種特異性的。由此推測(cè)，山融3號(hào)與

9、親本濟(jì)南177的品種特異性蛋白的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，體細(xì)胞雜交抑制某些mRNA翻譯成蛋白，而激活另一些原本不能翻譯的mRNA產(chǎn)生新蛋白。第三，鹽脅迫下在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變蛋白的比例明顯高于旱脅迫(根中高7.1-14.3％，葉中高28.6-32.2％)，說(shuō)明鹽脅迫能引起細(xì)胞更大范圍的脅迫應(yīng)答過(guò)程，使更多的脅迫響應(yīng)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，這與蛋白水平的狀況是一致的。 4.根和葉中鹽、早脅迫的差異表達(dá)蛋白的類(lèi)型明顯不同。1)光

10、合作用相關(guān)蛋白差別明顯，在葉中占25.81％，在根中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這類(lèi)蛋白。在根中鑒定了另外3種葉綠體蛋白，分別是谷氨酰氨合成酶葉同工酶，葉綠體前體(根45)、鐵氧還蛋白硝酸還原酶，葉綠體前體(根29)、轉(zhuǎn)酮酶，葉綠體(根4)，有關(guān)這些葉綠體蛋白在根中的作用有待進(jìn)一步研究。2)抗氧化相關(guān)蛋白有較大差異，山融3號(hào)根中的品種特異性抗氧化相關(guān)蛋白有6個(gè)而葉中只有1個(gè)。濟(jì)南177根中的品種特異性抗氧化蛋白有3個(gè)而葉中沒(méi)有。說(shuō)明根的抗氧化作用遠(yuǎn)比葉大，

11、而且山融3號(hào)的抗氧化能力比濟(jì)南177強(qiáng)。3)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白差異顯著。在根中共鑒定了6個(gè)而在葉中鑒定了3個(gè)。根中的液泡質(zhì)子ATP酶亞基(根70)和鉀離子通道β亞基(根86)在維持液泡質(zhì)子動(dòng)態(tài)平衡和離子的跨膜運(yùn)輸中具有重要作用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在應(yīng)對(duì)鹽、旱脅迫時(shí)根的作用比葉大。 5.體細(xì)胞雜交對(duì)小麥蛋白質(zhì)組產(chǎn)生顯著影響：1)體細(xì)胞雜交影響葉綠體和線粒體中蛋白質(zhì)的表達(dá)；2)相對(duì)于親本濟(jì)南177，山融3號(hào)中有些蛋白的表達(dá)被抑制，同時(shí)

12、合成一些新蛋白或使蛋白發(fā)生翻譯后修飾；3)體細(xì)胞雜交改變某些脅迫應(yīng)答蛋白的表達(dá)模式：如脫氫抗壞血酸還原酶(根38)在早脅迫下，濟(jì)南177根中表達(dá)上調(diào)20.3倍而山融3號(hào)中表達(dá)不變；在鹽脅迫下，濟(jì)南177根中表達(dá)上調(diào)14倍而山融3號(hào)根中表達(dá)上調(diào)25.1倍。過(guò)氧化氫酶(葉23)在旱脅迫下濟(jì)南177中表達(dá)不變而山融3號(hào)表達(dá)上調(diào)7.8倍，在鹽脅迫下濟(jì)南177中不表達(dá)而在山融3號(hào)中上調(diào)表達(dá)9.4倍。 總之，在蛋白質(zhì)組水平上，體細(xì)胞雜交使小

13、麥幼苗根與葉蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了全局性變化，使得山融3號(hào)光合作用系統(tǒng)、能量轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)以及離子動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其親本濟(jì)南177。正是這些系統(tǒng)性的變化提高了雜種中由多基因控制的數(shù)量性狀耐鹽、抗旱能力。無(wú)論在蛋白質(zhì)組水平還是在轉(zhuǎn)錄水平，鹽脅迫與早脅迫信號(hào)途徑既有重疊又有區(qū)別，表現(xiàn)為一部分脅迫響應(yīng)蛋白對(duì)鹽、旱脅迫的應(yīng)答模式不同。通過(guò)根與葉蛋白質(zhì)組的比較分析表明，根在對(duì)抗鹽、早脅迫時(shí)能夠發(fā)揮更重要的作用，根蛋白質(zhì)組比葉蛋白質(zhì)組