對華北大黑鰓金龜幼蟲具有活性的蘇云金芽胞桿菌篩選與鑒定.pdf

1、華北大黑鰓金龜[Holotrichia oblita(Falderman)]是難以防治的地下害蟲，給農(nóng)作物造成嚴(yán)重的損失。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種已被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的昆蟲病原微生物，其在芽胞形成期可產(chǎn)生主要由cry和cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白。發(fā)掘Bt菌株資源是實現(xiàn)此類害蟲綠色防控的重要手段，因此，為了獲得對華北大黑鰓金龜具有較高殺蟲活性的菌株，本研究以實驗室分離的500株Bt菌

2、株材料為基礎(chǔ)，通過殺蟲活性測定篩選對華北大黑鰓金龜幼蟲有活性的菌株，進一步對菌株多樣性分析、菌株晶體形態(tài)觀察和蛋白表達分析、基因鑒定和華北大黑鰓金龜幼蟲感染Bt后中腸組織病理切片等方面進行了一系列的研究，其主要結(jié)果如下:
　　對華北大黑鰓金龜幼蟲有活性菌株的篩選:以實驗室分離的500株Bt菌株為材料，通過殺蟲活性測定篩選到了42株對華北大黑鰓金龜幼蟲具有不同程度活性的菌株，其中有10株14天的校正死亡率大于60％，而261-1菌株

3、7天校正死亡率就達到100％，其余菌株的14天校正死亡率在30‰60％之間。
　　菌株多樣性分析:利用本實驗室建立的便捷的Bt菌株比較鑒別技術(shù)，對這42株菌株進行多樣性分析，以42株菌株的基因組為模板，利用優(yōu)化后的簡并引物和PCR擴增體系進行擴增，并利用Hinfl對PCR產(chǎn)物進行酶切，通過電泳分析獲得了33個菌株的RFLP圖譜，分析比較顯示它們屬于14個不同的菌株類型，從而有效的去除了冗余菌株，結(jié)合菌株對華北大黑鰓金龜?shù)臍⑾x活性數(shù)

4、據(jù)，選擇1126-1、P65-1、QDL47-1、261-1、FTL84、78-2、127-2、78-3、1198-1、S10A2、B8E12、QDL40-2、FCD114、B8E11等14株Bt菌株進行進一步鑒定。
　　菌株晶體形態(tài)觀察和蛋白表達分析:通過對14株Bt菌株的晶體形態(tài)電子顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，78-3、127-2和1198-1菌株能產(chǎn)生雙錐體型晶體;261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和112

5、6-1菌株能產(chǎn)生球形晶體，而其它5個菌株沒有晶體存在。通過SDS-PAGE分析了14株代表菌株表達蛋白情況，結(jié)果顯示菌株P(guān)65-1、1126-1、127-2、78-3、261-1、FCD114、1198-1和78-2能表達典型的約130 kDa的Bt Cry蛋白，QDL47-1和B8E11表達了約97 kDa蛋白，其余菌株表達了少量60 kDa的蛋白。
　　cry基因鑒定:利用cry3、cry8、cry18、cry23、cry37

6、、cry43類通用引物對14株Bt菌株進行進一步基因鑒定，結(jié)果顯示這14個菌株中，只有P65-1、1126-1、FCD114和78-2四個菌株分別含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea等5類cry8類新基因;而包括對華北大黑鰓金龜幼蟲活性最高的261-1菌株在內(nèi)的其它10個菌株均不含有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等對鞘翅目害蟲有效的殺蟲基因。質(zhì)譜鑒定結(jié)果也顯示了P6