血管周圍脂肪組織在腎血管性高血壓血管重構(gòu)中的作用.pdf

1、第一部分腎血管性高血壓大鼠模型的制備
　　研究背景：
　　高血壓是一種常見病，多發(fā)病，是全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。高血壓可引起身體許多器官產(chǎn)生疾病，其中以腦卒中和心肌梗死最常見，而成為人類致殘或死亡的主要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期以來(lái)，許多學(xué)者致力于高血壓的病因及發(fā)病機(jī)制研究，建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是開展這一研究的重要工具。形成腎動(dòng)脈高血壓大鼠的方法，通常用銀夾在腎動(dòng)脈上，一般是狹窄左腎動(dòng)脈保留右腎即“兩腎一夾”型（two-kidney

2、 one clip，2K1C）。這是經(jīng)典的制備高血壓模型的方法，其操作簡(jiǎn)便，成功率高，應(yīng)用廣泛。此類方法可應(yīng)用的動(dòng)物包括大鼠、小鼠、兔子、狗、豬、猴等。腎性高血壓在高血壓的發(fā)病中占有相當(dāng)比例，因此動(dòng)物腎動(dòng)脈狹窄制備出的高血壓模型，為臨床研究高血壓的發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。但銀夾壓迫腎動(dòng)脈模型較難成功，且銀夾材料較難獲得。本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)的采用銀針與絲線狹窄腎動(dòng)脈的方法，制備腎血管性高血壓大鼠模型并獲得成功。
　　研究方法：

3、
　　將SD大鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組采用銀針與手術(shù)縫線狹窄大鼠左腎動(dòng)脈，形成2K1C腎血管性高血壓模型。比較兩組大鼠手術(shù)前、手術(shù)后血壓情況。
　　研究結(jié)果：
　　2K1C高血壓大鼠模型在7d內(nèi)收縮壓、舒張壓升高，14d高血壓已初步形成，21d趨于穩(wěn)定，并持續(xù)在高水平。手術(shù)組與假手術(shù)組間收縮壓、舒張壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。手術(shù)成功率為86.7％。
　　結(jié)論：
　　采用銀針與手

4、術(shù)縫線狹窄腎動(dòng)脈形成2K1C腎血管性高血壓模型，可以在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下建立并有較高的成功率，符合高血壓實(shí)驗(yàn)研究的需要。
　　第二部分血管周圍脂肪組織在腎血管性高血壓中的作用
　　研究背景：
　　血管周圍脂肪組織（perivascular adipose tissue，PVAT）是圍繞在血管周圍的一層組織，主要由脂肪細(xì)胞組成。PVAT的研究往往與代謝綜合征聯(lián)系在一起，身體脂肪數(shù)量的增多或減少都會(huì)引起P VAT功能改變，

5、引起2型糖尿病或高血壓。已有研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)的腸系膜動(dòng)脈PVAT與正常血壓的WKY大鼠相比，SHR的血管周圍脂肪數(shù)量等同于或少于WKY大鼠的脂肪數(shù)量，而且形態(tài)上SHR的PVAT脂肪細(xì)胞體積小于正常大鼠PVAT的脂肪細(xì)胞體積。PVAT調(diào)節(jié)血管功能不僅在胸主動(dòng)脈這樣的大動(dòng)脈，而且也在對(duì)產(chǎn)生外周阻力作用更大的小動(dòng)脈上。可見，PVAT與高血壓也有著密切的聯(lián)系。

6、　　但PVAT功能的改變到底是高血壓的原因還是高血壓引起的結(jié)果尚不清楚，而且PVAT中脂肪細(xì)胞的功能改變及形態(tài)改變是否與高血壓水平一致亦尚未明確。因?yàn)镻VAT對(duì)動(dòng)脈的血管張力維持起著一定作用，而我們推測(cè)PVAT可能在高血壓發(fā)生初期形態(tài)上或功能上發(fā)生改變，處于動(dòng)態(tài)的平衡被打破后從而引起血管張力增加，致使血壓水平持續(xù)上升。本實(shí)驗(yàn)通過建立2K1C大鼠高血壓模型，初步檢測(cè)PVAT形態(tài)、功能的改變，從而為PVAT與高血壓相關(guān)性病的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

7、。
　　研究方法：
　　用2K1C建立腎性高血壓大鼠模型(同第一部份2K1C)，將20只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(SH)和腎性高血壓組（RH），術(shù)前及術(shù)后8周末檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓、心率，術(shù)后8周檢測(cè)動(dòng)脈環(huán)不帶血管外周脂肪組織的裸血管環(huán)[F（-）]和保留血管外周脂肪組織的血管環(huán)[F(+)]對(duì)苯腎上腺素(PHE)及乙酰膽堿(Ach)的反應(yīng)性;免疫組化法檢測(cè)一氧化氮合成酶(NOS)的表達(dá);光鏡下觀察PVAT中脂肪細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)，

8、并計(jì)算脂肪細(xì)胞的體積、胸主動(dòng)脈中層壁厚(MT)、血管內(nèi)徑(LD)及MT/LD。
　　研究結(jié)果：
　　SH組和RH組中帶有脂肪的胸主動(dòng)脈對(duì)PHE的收縮力同無(wú)脂肪的胸主動(dòng)脈對(duì)PHE的收縮力相比較，帶有脂肪的動(dòng)脈較無(wú)脂肪的動(dòng)脈對(duì)PHE的收縮反應(yīng)下降(P＜0.05)，而SH組對(duì)Ach的舒張反應(yīng)，在濃度為10-5mol/L和10-4mol/L上，F(xiàn)(+)和F（-）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，F(xiàn)(+)舒張反應(yīng)性較F(-)高;RH組

9、只有在10-4mol/L濃度上，F(xiàn)(+)較F(-)舒張反應(yīng)性高(P＜0.05)。RH組的血管NOS表達(dá)較SH組降低。PVAT中脂肪細(xì)胞形態(tài)與大小、兩組的動(dòng)脈結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別。
　　結(jié)論：
　　PVAT對(duì)血管舒縮有調(diào)節(jié)功能;在RH組血管周圍脂肪組織這種調(diào)節(jié)作用減弱;PVAT可能成為干預(yù)高血壓的新靶點(diǎn)。
　　第三部分血管周圍脂肪組織在腎血管性高血壓血管重構(gòu)中的作用
　　研究背景：
　　隨著高血壓的深入研究，證實(shí)高

10、血壓及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與血管重構(gòu)密切相關(guān)。高血壓過程中血管重構(gòu)的類型、特點(diǎn)以及發(fā)生機(jī)制成為高血壓研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。PVAT可能對(duì)于血管結(jié)構(gòu)的維持起到一定作用，因?yàn)镻VAT產(chǎn)生的許多分子影響了平滑肌細(xì)胞的增殖、游走。
　　腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，是一個(gè)重要的機(jī)體血壓及水電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的重要生物活性物質(zhì)，它是一系列酶促生化反應(yīng)的產(chǎn)物。除循環(huán)RAS外，局部組

11、織如心臟、血管壁、腦、腎等也能有效地生成AngⅡ，具有獨(dú)立的RAS系統(tǒng)。PVAT即為一個(gè)局部的RAS。因?yàn)镻VAT中的脂肪細(xì)胞富含有血管緊張素原及生產(chǎn)AngⅡ的所有酶，因此PVAT可產(chǎn)生AngⅡ。我們第一部分的研究證實(shí)P VAT與高血壓的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。因此，PVAT有可能通過RAS參與高血壓的血管重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)詣在高血壓大鼠PVAT中，觀察RAS各相關(guān)成分的表達(dá)與動(dòng)脈重構(gòu)的相關(guān)性。
　　研究方法：
　　用2K1C建立腎性高血

12、壓大鼠模型，將30只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(SH)和腎性高血壓組(RH)，術(shù)前及術(shù)后12周末檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓、心率。放射免疫法檢測(cè)脂肪組織AngⅡ水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血管緊張素原(AGT)和血管緊張素酶(ACE) mRNA表達(dá)。采用western blot檢測(cè)血管緊張素受體1(AT1)和受體2(AT2)蛋白表達(dá)。并檢測(cè)PVAT過氧化氫(H2O2)含量。
　　研究結(jié)果：
　　2K1C術(shù)后12周RH組大鼠胸主動(dòng)

13、脈發(fā)生血管重構(gòu)，AngⅡ水平、AGT、ACE mRNA表達(dá)均高于SH組，AT1蛋白表達(dá)量和H2O2含量也高于SH組，而AT2蛋白量表達(dá)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　PVAT與腎性高血壓血管重構(gòu)相關(guān)，活性氧(ROS)可能參與其發(fā)生機(jī)制。
　　第四部分血管周圍脂肪組織中AngⅡ介導(dǎo)VSMCs增殖的機(jī)制
　　研究背景：
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)PVAT與腎血管性高血壓血管重構(gòu)密切相關(guān)，然而P

14、VAT調(diào)節(jié)RAS誘導(dǎo)血管重構(gòu)機(jī)制目前并不清楚。在高血壓病理狀態(tài)下，NAD(P)H氧化酶系來(lái)源的ROS通過多種信號(hào)途徑介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musle cell，VSMCs)增殖、遷移，這是血管重構(gòu)的重要發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated protein kinase1/2，ERK1/2)是其中較重要的途徑之一。
　　PVAT中含有產(chǎn)生ROS

15、的主要酶:NAD(P)H氧化酶系，而AngⅡ可以刺激NAD(P)H產(chǎn)生ROS。研究報(bào)道，ROS家族成員HOCL能促使ERK1/2磷酸化而誘導(dǎo)血管VSMCs遷移。因此，本實(shí)驗(yàn)利用血管平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)H2O2、HOCL表達(dá)水平以及通過檢測(cè)VSMCs增殖指標(biāo)表達(dá)，探討在PVAT中，介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖及遷移的機(jī)制。
　　研究方法：
　　培養(yǎng)大鼠平滑肌細(xì)胞，MTT試驗(yàn)檢測(cè)AngⅡ處理后細(xì)胞增殖率，檢測(cè)AngⅡ處理后活性氧(

16、ROS)、H2O2及HOCL水平;預(yù)先予以NADPH抑制劑(apocynin)、H2O2水解酶（catalase）、ERK1/2抑制劑(PD98059)分別作用于AngⅡ處理的細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞總蛋白、細(xì)胞周期的影響，并檢測(cè)H2O2及HOCL含量的變化。
　　研究結(jié)果：
　　以AngⅡ終濃度100nM處理24h后可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，且ROS隨著升高;預(yù)先予以NADPH抑制劑apocynin、H2O2水解酶catalase、ER