養(yǎng)殖半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究以我國(guó)鲆鰈類(lèi)主導(dǎo)養(yǎng)殖品種—半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）為研究對(duì)象，針對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)無(wú)眼側(cè)黑化的表觀現(xiàn)象，運(yùn)用顯微觀察技術(shù)，研究了其皮膚黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞及鱗片的形態(tài)特征，探明了其數(shù)量分布與體色的關(guān)系；利用分子克隆技術(shù)克隆了黑化相關(guān)功能基因POMC，pMCH，MCHR，分析了其基因結(jié)構(gòu)和多態(tài)特性，探究了它們?cè)诟鱾€(gè)組織中的表達(dá)情況；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了POMC，pMCH，

2、MCHR在不同黑化程度實(shí)驗(yàn)魚(yú)的腦垂體和皮膚中的表達(dá)變化規(guī)律，分析了體色相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控與無(wú)眼側(cè)黑化程度的關(guān)系。研究結(jié)果可為半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化的細(xì)胞與分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下：
　　1.半滑舌鰨體表色素細(xì)胞形態(tài)、鱗片特征與黑化的關(guān)系
　　半滑舌鰨色素細(xì)胞類(lèi)型主要有3種：黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞。黑色素細(xì)胞較大，細(xì)胞直徑10-60μm，細(xì)胞形狀不規(guī)則，大體分為兩種類(lèi)型：一種樹(shù)突狀分枝不明顯；另一種延伸成

3、放射狀。黃色素細(xì)胞較小，圓形或橢圓形，細(xì)胞直徑1-5μm，視野下呈黃色。虹彩細(xì)胞較大，細(xì)胞直徑10-70μm，分布較均勻，形狀不規(guī)則，呈卵圓形、棒狀或多邊形等。半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)正常皮膚中未發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞分布，而無(wú)眼側(cè)黑化皮膚黑色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞的分布數(shù)量顯著低于有眼側(cè)正常皮膚（P＜0.05)。無(wú)眼側(cè)正常皮膚中黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞數(shù)量與有眼側(cè)正常皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚相比也較少。半滑舌鰨色素細(xì)胞主要在皮膚上分布（約占70％）。在無(wú)眼側(cè)黑化的皮

4、膚上，以延伸成放射狀的黑色素細(xì)胞分布為主（占60%以上），而在有眼側(cè)正常皮膚上，以樹(shù)突狀分枝不明顯的黑色素細(xì)胞分布為主；在無(wú)眼側(cè)黑化和有眼側(cè)正常鱗片上，都是以的分枝不明顯的黑色素細(xì)胞為主，且鱗片上的黑色素細(xì)胞分布相對(duì)稀疏。
　　生活史中，半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)鱗片類(lèi)型經(jīng)歷了櫛鱗→弱櫛鱗→圓鱗逐漸轉(zhuǎn)變的過(guò)程，但無(wú)眼側(cè)黑化區(qū)域的鱗片仍為櫛鱗，在無(wú)眼側(cè)黑化與正常皮膚交界處發(fā)現(xiàn)了弱櫛鱗。無(wú)眼側(cè)黑化魚(yú)的體表兩側(cè)櫛鱗的類(lèi)型與形態(tài)特征相似，但有眼側(cè)皮膚

5、、無(wú)眼側(cè)黑化皮膚和無(wú)眼側(cè)正常皮膚的鱗片上硬棘數(shù)量不同，提示半滑舌鰨無(wú)眼側(cè)黑化發(fā)生過(guò)程中鱗片形態(tài)及其調(diào)控機(jī)制也發(fā)生了明顯變化。
　　2.半滑舌鰨阿黑皮素原（POMC）的克隆和表達(dá)特性分析
　　首次從半滑舌鰨垂體中獲得了兩種POMC亞型-POMC-a和POMC-b cDNA全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)分別為910bp和844bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）分別為642bp和537bp，5’非編碼區(qū)分別為113bp和87bp，3’非編碼區(qū)分別為154

6、bp和210bp。POMC-a和POMC-b分別編碼213和178個(gè)氨基酸，除信號(hào)肽區(qū)域外，其序列均編碼促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），α-黑色素刺激素（α-MSH），β-黑色素刺激素（β-MSH），γ-促脂素（γ-LPH），β-內(nèi)啡肽，但缺失了γ-黑色素刺激素(γ-MSH)和大部分連接區(qū)域。POMC-a和POMC-b預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為23.7KDa和19.5KDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)分別為6.51和6.91。同源性分析顯示，半滑舌鰨POMC-

7、a的氨基酸序列與鰈形目、鱸形目的同源性為61.2%-66.5%，與黃鰭鯛的同源性最高；POMC-b的氨基酸序列與鰈形目、鱸形目的同源性達(dá)到51.8%-61.2%，與歐鰨的同源性最高。
　　半滑舌鰨POMC-a和POMC-b具有不同的組織表達(dá)特性，其中POMC-a mRNA主要在垂體表達(dá)，在腦、腸、有眼側(cè)皮膚和無(wú)眼側(cè)黑化皮膚中也有少量表達(dá)；POMC-b mRNA主要在垂體中表達(dá)，在腦、脾臟、肝臟和頭腎中有少量表達(dá)。無(wú)眼側(cè)黑化皮膚中P

8、OMC-a和POMC-b mRNA表達(dá)水平均顯著高于有眼側(cè)皮膚和無(wú)眼側(cè)正常皮膚。腦垂體和皮膚中POMC的表達(dá)與無(wú)眼側(cè)黑化程度密切相關(guān)，其中腦垂體POMC-a mRNA表達(dá)在無(wú)眼側(cè)50%黑化組達(dá)最高，皮膚POMC-a mRNA表達(dá)在10%黑化組最高，其后隨黑化程度增加而顯著降低。腦垂體POMC-b mRNA表達(dá)水平也在50%黑化組達(dá)峰值，皮膚POMC-b mRNA表達(dá)水平在10%黑化組最高，其后顯著下降。
　　3.半滑舌鰨黑色素富集

9、激素（MCH）的克隆和表達(dá)特性
　　首次從半滑舌鰨腦中獲得了pMCH2 cDNA全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)626bp，ORF長(zhǎng)為444bp，5’端非編碼區(qū)長(zhǎng)32bp，3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)150bp，共編碼147個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為16.2KDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.80。MCH2核心肽位于pMCH2序列379-441bp處，編碼21個(gè)氨基酸。pMCH1 cDNA部分序列ORF長(zhǎng)405bp，編碼134個(gè)氨基酸。MCH1位于pMCH1序列352-4

10、02bp處，編碼17個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為14.8KDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為6.22。同源性分析表明，半滑舌鰨MCH1、MCH2氨基酸序列都表現(xiàn)出與鰈形目魚(yú)類(lèi)最高的同源性（56%-66.9%）。
　　半滑舌鰨pMCH mRNA主要在垂體中表達(dá)。此外，pMCH1在有眼側(cè)皮膚、腸、性腺和腦中有少量表達(dá)，pMCH2在有眼側(cè)皮膚、性腺、腦、無(wú)眼側(cè)正常皮膚和鰓中有少量表達(dá)。皮膚中pMCH1和pMCH2 mRNA具有相反的表達(dá)趨勢(shì)，無(wú)眼側(cè)黑化皮

11、膚中pMCH1 mRNA表達(dá)顯著高于無(wú)眼側(cè)正常皮膚，而pMCH2 mRNA表達(dá)則顯著低。不同黑化程度表達(dá)中，MCH1 mRNA在腦垂體和皮膚中表現(xiàn)出類(lèi)似的表達(dá)變化趨勢(shì)，都在10%黑化組表達(dá)量達(dá)峰值，而后隨著黑化程度的加大顯著降低；MCH2在皮膚中則表現(xiàn)出隨黑化程度加大而表達(dá)顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)，表明MCH在腦垂體和皮膚層面參與了無(wú)眼側(cè)黑化性狀發(fā)生與發(fā)展的調(diào)控過(guò)程。
　　4.半滑舌鰨黑色素富集激素受體（MCHR）的克隆和表達(dá)特性
　

12、　首次從半滑舌鰨腦中獲得了MCHR1和MCHR2 cDNA全長(zhǎng)序列，cDNA全長(zhǎng)分別為1685bp和1626bp，ORF長(zhǎng)分別為1080bp和1044bp，5’非編碼區(qū)分別長(zhǎng)262bp和213bp，3’非編碼區(qū)分別為343bp和369bp。MCHR1和MCHR2分別編碼359和347個(gè)氨基酸，都包括7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。此外，在3’端末端都含有一個(gè)加尾信號(hào)AATAA。其預(yù)測(cè)蛋白分子量分別為23.7KDa和19.5KDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)分別為6.5

13、1和6.91。半滑舌鰨MCHR的氨基酸序列與鰈形目魚(yú)類(lèi)的同源性最高（81.8-91.6%）。
　　組織表達(dá)分析顯示，半滑舌鰨MCHR1 mRNA主要在鰓中表達(dá)，在脾、性腺和有眼側(cè)皮膚中有少量表達(dá)，MCHR2 mRNA主要在有眼側(cè)皮膚中表達(dá)，在性腺中有少量表達(dá)。MCHR在無(wú)眼側(cè)黑化皮膚中的表達(dá)量與無(wú)眼側(cè)正常皮膚、有眼側(cè)皮膚差異表達(dá)顯著。時(shí)空表達(dá)分析顯示，無(wú)眼側(cè)黑化發(fā)生早期MCHR1 mRNA顯著升高，在無(wú)眼側(cè)50%黑化組達(dá)峰值，皮膚