雞新城疫病毒F48E9的純化及其HN基因片段的原核表達(dá).pdf

1、實(shí)驗(yàn)室一般采用差速離心和密度梯度離心的方法來純化病毒，這種方法在工業(yè)上難以大量推廣。而人用疫苗的純化則多采用超濾，層析等方法，由于成本較高，在獸用疫苗上很難普遍采用。本研究借鑒蛋白質(zhì)提純的相關(guān)方法，利用硫酸胺、冷乙醇和PEG6000對雞新城疫病毒進(jìn)行了初步提純，并用紅細(xì)胞血凝實(shí)驗(yàn)對濃縮效果進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度為40％時(shí)硫酸銨對雞新城疫病毒的濃縮效果最好，可將病毒的血凝效價(jià)提高32倍；在冷乙醇終濃度為30％時(shí)對病毒的濃縮效果最好，可

2、以將病毒的血凝效價(jià)提高8倍；PEG6000的終濃度為20％時(shí)對雞新城疫病毒的濃縮效果最好，可將病毒的血凝效價(jià)提高16倍。本研究結(jié)果給獸用疫苗的純化提供了一定的借鑒意義。 新城疫是由新城疫病毒引起的禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)均被認(rèn)為是家禽和鳥類最重要的兩大疾病之一。目前雞新城疫尚無有效的治療藥物，疫苗接種是控制其爆發(fā)的主要手段，其中基因工程疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。同時(shí)雞新城疫病毒的相關(guān)單克隆抗體己廣泛用于病毒抗

3、原表位和發(fā)病機(jī)理，疫病診斷和流行病學(xué)分析等各項(xiàng)研究中。本研究選取了雞新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)中國強(qiáng)毒株F48E9 HN基因中基本上包含了其主要抗原位點(diǎn)的兩個(gè)基因片段，通過RT-PCR技術(shù)，成功地獲得了這兩個(gè)不交叉的基因片段，長度分別為790bp和579bp。而后將這兩段基因分別克隆到了pGEM-Tvector中，經(jīng)PCR和酶切鑒定后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明這兩段基因已經(jīng)成功地克隆到了pGEM-T vector中。 克隆出的兩個(gè)HN基因片段H

4、N1、HN2與原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)進(jìn)行了連接，成功地構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)中得到了表達(dá)；由于pET-28a(+)表達(dá)載體在起始密碼子之后有His(Tag)標(biāo)記，表達(dá)的目的融合蛋白N端含有His，能與Ni柱中的Ni2+結(jié)合，而其它蛋白不能結(jié)合在Ni柱上，所以利用Ni親和層析柱對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行了純化，通過SDS-PAGE電泳檢測，檢測出了經(jīng)過純化的目的蛋白。 本研究中得到的兩個(gè)HN蛋白為進(jìn)