產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌分子流行和質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶傳播機制研究.pdf

1、最近十年，產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌成為”超級耐藥”細(xì)菌并迅速傳遍全球，史無前例.2009年報道的來自印度NDA-1金屬酶、2004報道的土耳其OXA-48 D類酶以及2001年報道美國產(chǎn)生的A類KPC酶均分離自肺炎克雷伯菌，在短期內(nèi)均造成多地區(qū)的廣泛播散。同時，肺炎克雷伯菌是耐藥質(zhì)粒的“收藏家”，不僅增加自身的生存能力，而且還可以將耐藥質(zhì)粒傳播給其他菌種，造成耐藥基因的播散。自2007中國首次報道產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌后，已在局部地區(qū)造

2、成流行。本論文主要目的是研究產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌在中國的流行狀況及質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶基因傳播。
　　 本研究于2010年在全國20個省市的61家醫(yī)院收集2971株非重復(fù)的肺炎克雷伯菌，并選擇20種常見抗菌藥物開展體外藥物敏感性試驗。對碳青霉烯類抗生素耐藥或中介的肺炎克雷伯菌進行KPC型碳青霉烯酶檢測。改良Hodge確認(rèn)試驗和KPC基因特異引物PCR擴增及測序用于細(xì)菌產(chǎn)KPC酶的確定。采用多位點序列分型(multilocus s

3、equence typing，MLST)分型技術(shù)對產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌進行同源性分析。
　　 體外藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，2971株肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美洛培南和厄他培南的耐藥率分別為1.3％、1.9％和2.7％。肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs的檢出率為41.9％。75株碳青霉烯類抗生素耐藥或中介的肺炎克雷伯菌中有28株改良 Hodge試驗陽性，KPC擴增和測序發(fā)現(xiàn)有25株KPC-2基因陽性。產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌主要來自浙

4、江?。?0株），并在北京、遼寧、湖北、上海和江蘇各檢測到1株。2010年中國多地區(qū)產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌的檢出率0.84％。
　　 25株產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌MLST分型檢測發(fā)現(xiàn)，有17株為ST11，占68％;4株為ST494，4株為未知型，屬于新的ST型。北京、遼寧、湖北、上海和江蘇菌株均為ST11。4株肺炎克雷伯菌ST494來自浙江的同一家醫(yī)院。
　　 本課題同時對來源于湖北一家省級兒童醫(yī)院分離的4株產(chǎn)碳青

5、霉烯酶肺炎克雷伯菌進行研究。采用PCR擴增及測序檢測β內(nèi)酰胺酶基因、MLST和脈沖場凝脈電泳(PFGE)技術(shù)進行細(xì)菌同源性分析，應(yīng)用質(zhì)粒PFGE、接合及轉(zhuǎn)化試驗、質(zhì)粒抽提、Southern雜交等技術(shù)進行質(zhì)粒分析及β-內(nèi)酰胺酶基因在質(zhì)粒中的定位。
　　 同源性分析顯示4株肺炎克雷伯菌PFGE圖譜條帶及數(shù)量相同，MLST分型均力ST439，提示4株細(xì)菌為同一克隆。質(zhì)粒圖譜結(jié)果表明4株細(xì)菌攜帶的質(zhì)粒大小在30到300kb這間，KPC-

6、2基因位于30kb大小的質(zhì)粒上，IMP-4基因定位于300kb質(zhì)粒，CTX-M-15基因位于80kb大小的質(zhì)粒上，DHA-1基因分別位于80kb和300kb的2個質(zhì)粒上。本研究證實在肺炎克雷伯菌中同時產(chǎn)生A類碳青霉烯酶(KPC-2)、金屬碳青霉烯酶(IMP-4)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(CTX-M-15)和質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶(DHA-1)。
　　 本課題還對分離自同一病人的1株嗜水氣單胞菌、2株大腸埃希菌和2株產(chǎn)氣腸桿菌進行藥敏試

7、驗、質(zhì)粒消除、PCR步移、質(zhì)粒分析等分子生物學(xué)技術(shù)研究，明確編碼KPC基因在不同質(zhì)粒中的定位及攜帶KPC基因的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株臨床分離細(xì)菌均顯示對亞胺培南、美洛培南和厄他培南高水平耐藥，MIC值均＞32 mg/L。通過質(zhì)粒消除試驗，嗜水氣單胞菌含KPC基因的質(zhì)粒被去除后，細(xì)菌對亞胺培南、美洛培南和厄他培南MIC值明顯降低。
　　 PCR擴增及測序證實在2株產(chǎn)氣腸桿菌均含有blaKPC-2，blaTEM-1

8、，blaSHV-12和blaDHA-1，而它們的接合子中只含blaKPC-2和blaTEM-1。2株大腸埃希菌中檢測到blaKPC-2和blaSHV-12，而它們的轉(zhuǎn)化子或接合子中只檢測到blaKPC-2。臨床分離的嗜水氣單胞菌和它的接合子只含blaKPC-2，而質(zhì)粒消除的嗜水氣單胞菌blaKPC-2檢測陰性。
　　 質(zhì)粒電泳圖譜分析發(fā)現(xiàn)所有5株臨床細(xì)菌都含有3-5個大小不等的質(zhì)粒。分子雜交表明KPC基因位于嗜水氣單胞菌和大腸埃

9、希菌的30kb可接合或轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒上，而2株產(chǎn)氣腸桿菌攜帶KPC基因的質(zhì)粒大小不同，分別為200kb和170kb左右。對嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)化子進行PCR步移法及測序獲得一個11467bp核苷酸片段，結(jié)構(gòu)依次為Tn3的轉(zhuǎn)座酶和解旋酶、部分缺失的TEM、ISKpn8、KPC-2、ISKpr6-like、 KorC、KlcA和有缺失的起始復(fù)制蛋白基因。該結(jié)構(gòu)同時還在其他4株細(xì)菌中檢測到。
　　 本研究首次在氣單胞菌屬細(xì)菌中檢測到KPC-2型