MS-275對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、近年來(lái)，齲病作為臨床上的常見(jiàn)病之一，越來(lái)越引起人們的關(guān)注，齲病的形成主要是由于細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物侵害牙本質(zhì)，造成牙體硬組織脫礦，最終形成缺損。而當(dāng)細(xì)菌和其致病因子毒力較強(qiáng)且持續(xù)作用時(shí)，則會(huì)通過(guò)牙本質(zhì)小管導(dǎo)致牙髓組織的損傷。在受到嚴(yán)重刺激后，牙髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞即牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）會(huì)遷移并黏附到受損組織，在多種因素調(diào)控下，向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化并產(chǎn)生牙本質(zhì)基質(zhì)，進(jìn)行組織修復(fù)，這為牙齒的修復(fù)再

2、生奠定了堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是一類(lèi)催化組蛋白去除乙?；^(guò)程的酶類(lèi)，在調(diào)控機(jī)體乙?；街邪l(fā)揮重要作用，而機(jī)體的乙?；脚c腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，而且在干細(xì)胞增殖，分化的調(diào)控中有重要作用。我們前期研究結(jié)果表明，在hDPSCs成骨/成牙分化過(guò)程中，HDAC1的基因表達(dá)量隨時(shí)間增加顯著下調(diào)，提示HDAC1可能參與調(diào)控hDPSCs的分化過(guò)程。
　　MS-

3、275（Entinostat,SNDX-275）是HDAC1的特異性抑制劑，屬于苯甲酰胺類(lèi)，它可以選擇性的抑制第一類(lèi)HDAC，特別是HDAC1，調(diào)控組蛋白的乙?；?，從而影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平，與其他種類(lèi)的HDACs抑制劑相比，MS-275具有細(xì)胞毒性低和抗腫瘤效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此成為臨床上一類(lèi)重要的抗腫瘤藥物。MS-275能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)在胚胎干細(xì)胞的成神經(jīng)分化中發(fā)揮重要作用。
　　組織工程

4、技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織器官再生中得到了廣泛應(yīng)用，而各種材料的合理應(yīng)用成為組織工程技術(shù)中重要的環(huán)節(jié)，目前納米材料在組織修復(fù)再生中應(yīng)用廣泛，而仿生多孔納米纖維明膠支架材料（nano-fibrous gelatin（NF-gelatin）hybrid scaffolds）是一種新型的三維立體結(jié)構(gòu)的支架材料，在物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成上都與自然形成的牙本質(zhì)相類(lèi)似，這種三維結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)干細(xì)胞的粘附、增殖、遷移和分化能力，在組織工程應(yīng)用中有很大前景，因此我們

5、選用該材料進(jìn)行進(jìn)一步研究。本課題旨在成功分離、培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究 MS-275對(duì) hDPSCs增殖和分化能力的影響，進(jìn)一步明確HDAC1在hDPSCs增殖和分化中的作用，為牙齒損傷修復(fù)與再生提供理新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究成果如下：
　　1.hDPSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們?nèi)?8-22周歲年輕患者因正畸或阻生拔除的健

6、康恒牙，用組織塊與酶消化聯(lián)合法分離、培養(yǎng)hDPSCs，再通過(guò)有限稀釋法挑取單細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。我們通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物，通過(guò)成骨、成脂誘導(dǎo)后茜素紅染色和油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞的多向分化能力，證明我們成功分離和培養(yǎng)出hDPSCs。
　　2.MS-275對(duì)體外培養(yǎng)的hDPSCs增殖及分化的研究
　　我們前期研究結(jié)果表明，在hDPSCs成骨/成牙分化過(guò)程中，HDAC1的基因表達(dá)量隨時(shí)間的增加顯著下調(diào)，為了進(jìn)一步探索HDA

7、C1在hDPSCs中的作用，我們選擇其特異性抑制劑MS-275作為研究對(duì)象。我們選取20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275誘導(dǎo)二維平面的hDPSCs，通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同濃度的MS-275均對(duì)hDPSCs的增殖有抑制作用，且20μM MS-275對(duì)細(xì)胞有毒性。而經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后，與對(duì)照組相比，2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進(jìn)hDPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關(guān)基因和蛋白ALP、

8、DSPP、OCN和BSP的表達(dá)，且2μM MS-275促進(jìn)hDPSCs成骨/成牙向分化的作用更強(qiáng)。
　　3.MS-275對(duì)在仿生多孔納米明膠支架材料上培養(yǎng)的hDPSCs增殖及分化的研究
　　我們將hDPSCs與20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275處理后的納米明膠支架材料相復(fù)合，通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在三維立體環(huán)境下，所測(cè)不同濃度的MS-275均對(duì)hDPSCs的增殖有抑制作用，且20μM MS-

9、275對(duì)細(xì)胞有毒性。而經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后，2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進(jìn)hDPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關(guān)基因和蛋白ALP、DSPP、OCN、BSP的表達(dá)，且2μM MS-275促進(jìn)hDPSCs成骨/成牙向分化的作用更明顯。將hDPSCs與材料復(fù)合物進(jìn)行裸鼠皮下移植結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，HE染色和Masson’s染色表明2μM MS-275能夠顯著促進(jìn)材料上膠原纖維的生成，Von Kossa染色顯示2μM M