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文檔簡介
1、腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期的共同途徑和主要病理特征,其病理改變表現(xiàn)為腎小管萎縮,間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度積聚。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明,腎小管間質(zhì)病變程度預(yù)示著腎功能受損的程度,決定慢性腎臟病患者的預(yù)后。間質(zhì)纖維化的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,目前尚無有效的方法阻斷腎纖維化的進(jìn)展。
雷帕霉素是一種從放線菌培養(yǎng)液中提取出來的大環(huán)內(nèi)酯類化合物,其在體內(nèi)的
2、直接作用靶點(diǎn)是mTOR(mammalian target of rapamycin)。mTOR是控制細(xì)胞生長和增殖所必需的絲/蘇氨酸激酶,雷帕霉素通過與mTOR結(jié)合后,激活細(xì)胞生長抑制和存活反應(yīng),因其對細(xì)胞具有非選擇性抑制增殖作用,其研究及應(yīng)用廣泛,目前在臨床上主要作為免疫抑制劑,主要用于器官移植抗排異反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道,RAP可抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖,包括抑制PKD大鼠模型囊性和非囊性小管的增殖,并可減輕腎間質(zhì)纖維化,但其作用機(jī)制卻未
3、完全明確。本研究通過對大鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteric obstruction,UUO)建立腎間質(zhì)纖維化模型,動(dòng)態(tài)觀察雷帕霉素對梗阻側(cè)腎臟的病理改變及生化指標(biāo)的影響,觀察雷帕霉素對腎臟纖維化進(jìn)程中AQP2與EnaC,Bcl-2與Bax、casepase-3等相關(guān)調(diào)控因子的影響,tune1染色觀察其對凋亡的影響,深入探討其對腎間質(zhì)纖維化的影響及可能機(jī)制,為臨床防治腎間質(zhì)纖維化尋找新的途徑。
第一部分
4、:雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎功能及殘余腎組織形態(tài)學(xué)的影響
目的:觀察雷帕霉素對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎臟病變的影響
材料與方法:
1.動(dòng)物模型制備與分組給藥
72只雄性wistar大鼠(購于溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組,單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO),雷帕霉素干預(yù)組(Rap)。假手術(shù)組開腹后游離左側(cè)輸尿管隨即縫合皮膚,UUO組和雷帕霉素治療組進(jìn)行左側(cè)輸尿管雙結(jié)扎,治療組在UUO的基礎(chǔ)
5、上每天以雷帕霉素2mg/Kg.d(0.4ml/d)灌胃;假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃。
三組大鼠分別于術(shù)后第4天,7天、14天處死前留取24小時(shí)尿,進(jìn)行24h尿蛋白及尿鈉檢測;于處死時(shí)末股動(dòng)脈取血,檢測血清BUN、Cr,取部分腎組織行HE、Masson染色光鏡下觀察腎臟病理改變,并采用百分比評分法進(jìn)行腎臟間質(zhì)纖維化指數(shù)的半定量分析。
結(jié)果:
三組于第4,7,14天尿鈉水平比較未見明顯差異(P>0.
6、05),第14天數(shù)值Rap組高于UUO組,與假手術(shù)組比略低,三組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后第4、7、14天,假手術(shù)組,與UUO組及Rap治療組的24h尿蛋白定量三組無顯著性差異(P>0.05);各組大鼠的血肌酐,血尿素氮在各時(shí)間點(diǎn)比較未見明顯差異(P>0.05);HE與Masson染色示:假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)腎臟未見病理病變。UUO組術(shù)后第4天出現(xiàn)腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及輕微腎間質(zhì)纖維化,并隨梗阻時(shí)間的延長而加重,Rap與UUO組在各時(shí)間點(diǎn)相比
7、較,腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化相對減輕;腎間質(zhì)纖維化的半定量分析示UUO組與假手術(shù)組比較,腎間質(zhì)纖維化明顯(P<0.05);Rap組腎間質(zhì)纖維化明顯輕于UUO組(P<0.05)。
結(jié)論:
雷帕霉素可減輕腎間質(zhì)纖維化的程度,對梗阻腎臟具保護(hù)作用。
第二部分:雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織AQP2及ENaC表達(dá)的影響
目的:
通過測定梗阻側(cè)腎臟AQP2及ENaC的表達(dá)探討雷帕霉素對梗阻腎
8、功能保護(hù)作用。
方法:
動(dòng)物模型制備與分組給藥同第一部分;用免疫組化法觀察腎組織AQP2及ENaC的表達(dá),Westem雜交分析法檢測AQP2及ENaC蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:
各組大鼠腎組織AQP2及ENaC蛋白的免疫組織化學(xué)分析:EnaC在假手術(shù)組中各時(shí)間點(diǎn)均可于腎臟近髓質(zhì)連接管和集合管上皮細(xì)胞見大量棕黃色顆粒,AQP2于腎臟髓質(zhì)深部集合管部上皮細(xì)胞胞漿及胞膜處大量表達(dá),二者在腎間質(zhì)及腎小球未見表
9、達(dá);UUO組、Rap組較假手術(shù)組表達(dá)陽性細(xì)胞減少,表達(dá)強(qiáng)度減弱(P<0.01);與雷帕霉素組比較,UUO組減少更為明顯(P<0.05)。
AQP2及ENaC蛋白表達(dá)的Western Blot定量分析結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致
結(jié)論:
在單側(cè)輸尿管梗阻腎間質(zhì)纖維化模型中,雷帕霉素減少了AQP2及ENaC蛋白的丟失。
第三部分:雷帕霉素對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3表達(dá)
10、的影響
目的:
通過測定梗阻側(cè)腎臟tunel結(jié)果及Bcl-2與Bax及easepase-3蛋白的表達(dá)對雷帕霉素減輕腎間質(zhì)纖維化和腎功能保護(hù)的機(jī)理進(jìn)行初步探討
方法:
1.動(dòng)物模型制備與分組給藥同第一部分。
2.大鼠殘余腎冰凍切片Tunel法染色觀測細(xì)胞凋亡活性
3.免疫組織化學(xué)法與Western Blot檢測Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白表達(dá)的方法
結(jié)果
11、:
1.組織凋亡活性
假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)僅見有少量凋亡細(xì)胞;UUO組、Rap組可見大量凋亡細(xì)胞細(xì)胞,于第7天最多,第14天減少,二者明顯高于假手術(shù)組比,P<0.05;與UUO組比較,Rap組明顯減少,P<0.05。
2.各組大鼠腎組織Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的免疫組織化學(xué)檢測
假手術(shù)組Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白于腎小管,腎間質(zhì)及腎小球僅有極少量表達(dá),各時(shí)間點(diǎn)一致
12、,P>0.05;在UUO組Bcl-2蛋白于術(shù)后第4天可見明顯表達(dá),主要分布腎小管胞質(zhì),腎間質(zhì)及腎小球僅見少量表達(dá),第7天達(dá)高峰,第14天明顯下降;Rap組表達(dá)的時(shí)間與區(qū)域與UUO組一致,其染色強(qiáng)度及區(qū)域高于UUO組,P<0.05;
Bax及casepase-3蛋白在UUO組、Rap組于術(shù)后第4天可見主要在腎小管尤其遠(yuǎn)端肥大或管腔增大的腎小管上皮細(xì)胞(Bax主要在胞質(zhì),casepase-3主要在胞核)表達(dá),腎間質(zhì)及腎小球皆亦見明
13、顯表達(dá),于第7天達(dá)高峰,第14天下降,此時(shí)腎小球的表達(dá)量亦有所增加;但Rap組Bax及casepase-3蛋白染色強(qiáng)度及區(qū)域低于UUO組,P<0.05。
3.Western Blot檢測Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白的表達(dá)
各組大鼠蛋白在分子量為26kDa,22kDa及35kDa處依次可見Bcl-2、bax及Caspase-3條帶。Bcl-2與Bax及casepase-3蛋白假手術(shù)組蛋白條帶淡,幾乎未見
14、明顯表達(dá),于各時(shí)間點(diǎn)一致,與其他兩組相比其IOD值最低(P<0.05);對Bcl-2蛋白條帶行進(jìn)行定量分析,在Rap組與UUO組,其蛋白表達(dá)量在時(shí)間變化上第7天最高,第14天最低,Rap組表達(dá)高于UUO組(P<0.05); Bax、casepase-3蛋白R(shí)ap組及UUO組在各時(shí)間點(diǎn)上變化規(guī)律一致,于術(shù)后第7天達(dá)高峰,第14天下降,但表達(dá)量上仍高于第4天,UU0組Bax蛋白表達(dá)優(yōu)于Rap組(P<0.05)。
結(jié)論:
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