禽白血病病毒衣殼蛋白與囊膜蛋白單克隆抗體制備及診斷試劑盒研制.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的雞的腫瘤性疾病。它可以使雞直接發(fā)病，產(chǎn)生腫瘤而死亡;也可以導(dǎo)致感染雞產(chǎn)生免疫抑制，繼發(fā)多種病原的混合感染，使病雞對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能。2008年以來(lái)，禽白血病尤其是J亞群禽白血病在我國(guó)大部分省份不同程度的爆發(fā)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。禽白血病目前沒(méi)有有效的防治措施。預(yù)防本病的主要方法是淘汰陽(yáng)性雞，凈化種群。因此利用群特異性

2、或亞群特異性單克隆抗體(Monoc lonal Antibody, MAb)建立ALV抗原診斷方法對(duì)于臨床上ALV的診斷凈化、防控、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等具有重要意義。
　　p27蛋白作為ALV的群特異性抗原，因其序列高度保守并且含有許多易于被檢測(cè)的抗原位點(diǎn)而成為制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本研究首先對(duì)p27蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與純化，利用雜交瘤技術(shù)制備了針對(duì)p27蛋白的4株MAb，分別命名為3A9、2E5、3D5、3H12。然后利用肽掃描(Pe

3、pscan)技術(shù)對(duì)p27蛋白的表位信息進(jìn)行分析，得到一個(gè)線性p27蛋白表位181ppSAR185，該表位在ALV各個(gè)亞群之間高度保守，是群特異性表位。以制備的MAb2E5作為捕獲抗體，MAb3D5作為檢測(cè)抗體建立了禽白血病病毒群特異性抗原ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，確立了該方法的最佳程序。該方法特異性好，可與家禽常見(jiàn)的A、B和J亞群ALV反應(yīng)，但不與其他禽病病原如NDV、IBDV、MDV、AIV等反應(yīng)。該方法對(duì)重組p2

4、7蛋白的最低檢測(cè)量為1.25ng/mL，敏感性略高于美國(guó)IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(ALVAg)試劑盒。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，同一樣品的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10％。保存期實(shí)驗(yàn)表明，該試劑盒在4℃保存一年后對(duì)陰陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果仍然具有良好的穩(wěn)定性。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)研制的試劑盒與美國(guó)IDEXX試劑盒對(duì)2555份泄殖腔拭子檢測(cè)結(jié)果的總符合率為96.32％;對(duì)1141份蛋清

5、樣品檢測(cè)結(jié)果的總符合率為97.20％。人工感染實(shí)驗(yàn)表明，PCR檢測(cè)方法最早檢出陽(yáng)性結(jié)果為攻毒后11日，本實(shí)驗(yàn)研制的ELISA檢測(cè)試劑盒最早檢出陽(yáng)性結(jié)果為攻毒后12日。
　　gp85蛋白在ALV各亞群之間具有高度的變異性，同源性很低，約為30％，具有亞群特異性。本研究首先對(duì)gp85蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與純化，制備了針對(duì)這個(gè)蛋白的MAb，命名為4A3。MAb4A3不能與ALV-A和ALV-B反應(yīng)，但是能夠與不同國(guó)家、時(shí)間、地域分離的ALV

6、-J毒株發(fā)生特異性反應(yīng)。然后利用肽掃描(Pepscan)技術(shù)鑒定出gp85蛋白的一個(gè)線性表位134AEAELRDFI142，該表位在不同的ALV-J毒株之間高度保守，是亞群特異性表位。針對(duì)gp85蛋白的MAb和表位的研究為接下來(lái)建立以MAb為基礎(chǔ)的J亞群ALV抗原診斷方法奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　本研究共得到4株抗p27蛋白和1株抗ALV-J gp85蛋白的MAbs，鑒定出1個(gè)p27蛋白抗原表位和1個(gè)gp85蛋白抗原表位，為進(jìn)一步研