獼猴桃病毒種類(lèi)鑒定及分子特性研究.pdf

1、近幾年，本研究室在田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，獼猴桃病毒病在我國(guó)保存的獼猴桃種質(zhì)資源及栽培獼猴桃植株上發(fā)生較普遍。為明確侵染我國(guó)獼猴桃的病毒種類(lèi)、危害特點(diǎn)及其分子特性，本研究根據(jù)已報(bào)道的獼猴桃病毒序列合成或設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)首次在從我國(guó)種植獼猴桃上檢測(cè)到獼猴桃病毒A(Actinidia virusA，AcVA)和獼猴桃病毒B(Actinidia virusB，AcVB)，并通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析，明確對(duì)其分子特性和變異特點(diǎn)。此外，采用

2、小RNA(sRNA)深度測(cè)序技術(shù)從獼猴桃上鑒定出一種新的Emaravirus屬病毒，并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。取得的研究結(jié)果如下:
　　1.2013-2014年，從湖北、安徽、陜西、浙江、江西和云南6省共采集6個(gè)種（或亞種）及其它未知種獼猴桃葉片樣品151份，多數(shù)采樣植株的葉片表現(xiàn)褪綠斑駁、褪綠環(huán)紋、脈黃和花葉等癥狀。采用RT-PCR技術(shù)對(duì)這些獼猴桃樣品的AcVA和AcVB進(jìn)行檢測(cè)，在所收集的中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃、狗

3、棗獼猴桃、葛棗獼猴桃和毛花獼猴桃樣品中，均檢測(cè)到AcVA或AcVB，檢出率分別為15.2％和17.9％。
　　2.采用3對(duì)引物分別擴(kuò)增AcVA的ORF1、ORF4和ORF5部分片段，擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)果顯示，AcVA的ORF1、ORF4和ORF5擴(kuò)增片段序列存在較大分子變異，不同分離物的269bp片段（ORF1）核苷酸序列相似性為77.3-99.3％。ORF4擴(kuò)增片段大小為597bp，分離物間的核苷酸序列相似性為88.1-99.8

4、％。所測(cè)定分離物與新西蘭分離物TP7-93A相應(yīng)片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為88.4-90.6％和94.2-100％。ORF5擴(kuò)增產(chǎn)物為283bp，各分離物間擴(kuò)增片段的核苷酸序列相似性為89.0-100％，與新西蘭報(bào)道的AcVA分離物TP7-93A的相應(yīng)片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為90.1-94％和94.6-96.8％。在基于各擴(kuò)增片段核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，AcVA分離物聚為2-3組。
　　3.采用兩對(duì)引物Ac

5、VB5F/Ⅵti3'R和AcVB5F/AcVB5R分別獲得3個(gè)和20個(gè)AcVB分離物的ORF5片段序列。引物AcVB5F/AcVB5R擴(kuò)增產(chǎn)物大小為342bp或338bp。序列分析結(jié)果顯示，各分離物的ORF5擴(kuò)增片段之間的核苷酸和編碼氨基酸序列相似性分別為81-100％和75.5-100％。所測(cè)定分離物與新西蘭報(bào)道的AcVB分離物TP7-93B相應(yīng)片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為83.9-99.7％和79.8-100％。這些分離物在

6、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中聚為3組。
　　4.采用sRNA深度測(cè)序方法，從獼猴桃樣品Ac HN-6鑒定出一種新病毒，命名為獼猴桃褪綠環(huán)斑伴隨相關(guān)病毒(Actinidia chlorisis ringspot-associated virus，ACRaV)。測(cè)定了該病毒基因組序列。ACRaV為負(fù)單鏈RNA病毒，基因組由5條RNA鏈組成，RNA1-RNA5大小分別為7061nt、2267nt、1678nt、1664nt和1476nt，每條RNA鏈包

7、含一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），ORF1，ORF2和ORF3分別編碼依賴(lài)RNA的RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白(GP)和外殼蛋白(CP)，推測(cè)ORF4編碼運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白，ORF5編碼蛋白的功能未知。ACRaV基因組結(jié)構(gòu)與歐洲山梣環(huán)斑病毒屬（Emaravirus）病毒相似，ORF1-4編碼的蛋白(P1-P4)與紫荊黃色環(huán)斑病毒（Redbudyellow ringspot virus，RYRV）的相應(yīng)蛋白氨基酸序列相似性最高，分別為64.6％，

8、48.3％，55.6％和51.9％; P5與該屬其它病毒相應(yīng)蛋白氨基酸序列相似性低于23％。在基于該病毒的P1-P3的氨基酸序列及布尼亞病毒科（Bunyaviridae）不同屬的代表種相應(yīng)蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)中，ACRaV與Emaravirus屬病毒聚在同一分支。這些結(jié)果表明，ACRaV為Emaravirus屬的一個(gè)新種。
　　5.在ACRaV的ORF1和ORF3區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)從7個(gè)省收集的146份