人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植在顱腦損傷的作用研究.pdf

1、目的:
　　 建立大鼠液壓沖擊顱腦損傷模型，探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)移植對顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響以及移植細(xì)胞的存活、遷移和神經(jīng)分化情況，為其在顱腦損傷治療的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶，利用酶消化法和貼壁法獲得原代細(xì)胞，傳3～5代備用。收集消化后的細(xì)胞，流式細(xì)胞學(xué)檢測

2、CD45PE、CD90PE、CD105PE、CD73PE、CD11bPE和CD34FITC、CD19FITC，HLA-DRPE，并以小鼠IgG1-PE和小鼠IgG1-FITC作為同型對照。
　　 選取成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重約260g～320g，制作液壓沖擊顱腦損傷模型。模型制備成功24小時后，采取改良神經(jīng)功能評分(modifiedNeurologicalSeverityScore，mNSS)對

3、其進行神經(jīng)功能評價(Table1)，選取評分為7～12分（中度）的50只大鼠進入實驗。將其隨機分為三組:
　　 (1)hUC-MSCs移植組:20只，細(xì)胞移植前用噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazol-2-yl-2,5-diphenytetrazoliumbromide,MTT]檢測細(xì)胞活力。將第5代hUC-MSCs移植到大鼠顱腦損傷部位。
　　 (2)磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffere

4、dsaline，PBS)組:20只，用PBS替代hUC-MSCs注射到顱腦損傷部位。
　　 (3)單純顱腦損傷:10只，行開骨窗和顱腦損傷處理，但不移植hUC-MSCs。另外，再隨機選取10只大鼠為假手術(shù)組，只開骨窗，不行顱腦損傷處理，亦不行細(xì)胞移植。
　　 四組大鼠分別采用改良的神經(jīng)功能評分(modifiedneurologicalseverityscore，mNSS)在hUC-MSCs移植或PBS注射后的第1天、7天

5、、14天、21天、28天進行神經(jīng)功能評分，觀察其神經(jīng)功能改善情況。評分結(jié)束后采用RT-PCR技術(shù)檢測移植細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecificenolase，NSE)、巢蛋白(Nestin)以及髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)的表達(dá)情況，并進行比較。
　　 結(jié)果:
　　 細(xì)胞接種4～6h后觀

6、察到少量細(xì)胞貼壁，12h以后大部分細(xì)胞貼壁。接種7d時，細(xì)胞匯合達(dá)到80％～90％，消化后按1∶2或1∶3的比例傳代。細(xì)胞傳代后，形態(tài)均一，生長迅速，3-4d可傳一代。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示:hUC-MSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD105、CD73、CD90，不表達(dá)B型淋巴細(xì)胞表面抗原CD19、造血前體細(xì)胞表面抗原CD34、白細(xì)胞表面抗原CD45、中性粒細(xì)胞表面抗原CD11b和HLA-DR，表示該細(xì)胞是hUC-MSCs且具備異體移植

7、的可行性。細(xì)胞移植前采用MTT法檢測hUC-MSCs細(xì)胞活力好，臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率達(dá)95％以上。
　　 hUC-MSCs移植后28d內(nèi)，hUC-MSCs移植組死亡2只，死亡率為10.0％;PBS組死亡6只，死亡率為30.0％;單純顱腦損傷組死亡4只，死亡率40.0％。hUC-MSCs移植組死亡率低于單純顱腦損傷組和PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 神經(jīng)功能評分結(jié)果(Table3)顯示，hUC-MS

8、Cs移植組隨著時間的變化神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于單純顱腦損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 hUC-MSCs移植28天，神經(jīng)功能評分結(jié)束后，取新鮮腦組織提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR從分子生物學(xué)證實了移植的hUC-MSCs在大鼠顱腦損傷部位存活并表達(dá)GFAP、NSE、Nestin，未表達(dá)MBP。
　　 結(jié)論:
　　 1、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　 2、移植的hUC