瘦肉型豬精液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶同工酶的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-32陰離子交換柱、Sephadex G-100分子篩柱和CM-52陽(yáng)離子交換柱，從豬精液中提取出堿性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，EC 3.3.1.52，簡(jiǎn)稱NAGase)和酸性NAGase，比活力分別為17606.15 U/mg和1773.25 U/mg。兩種酶的提取液經(jīng)PAGE檢測(cè)，均呈現(xiàn)一條蛋白條帶。堿性NAGase經(jīng)SDS-PAGE平板電

2、泳呈現(xiàn)1種蛋白條帶，亞基分子質(zhì)量為64.30 kD，酸性NAGase則呈現(xiàn)2種蛋白條帶，亞基分子質(zhì)量分別為129.13 kD和62.24kD。堿性NAGase和酸性NAGase的等電點(diǎn)分別為9.42和5.10。以對(duì)-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)為底物，進(jìn)行酶催化底物水解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果表明：堿性NAGase和酸性NAGase催化底物反應(yīng)的最適pH都是5.50，分別在pH3.0～8.90和pH 3.6～9.

3、2區(qū)域較穩(wěn)定；最適溫度分別為50℃和60℃，酶活力分別在10℃～45℃和10℃～55℃的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。堿性NAGase符合米氏雙曲線方程，對(duì)于酸性NAGase，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.7 mmol/L時(shí)符合，底物濃度高于0.7 mmol/L時(shí)出現(xiàn)了底物抑制酶活性的現(xiàn)象。測(cè)得堿性NAGase米氏常數(shù)Km為1.94 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vm為27.53μmol/L/min，催化pNP-β-D-GlcNAc反應(yīng)的活化能為88.73 kJ/m

4、ol。酸性NAGase米氏常數(shù)Km為0.46 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vm為17.34μmol/L/min，催化pNP-β-D-GlcNAc反應(yīng)的活化能為41.70 kJ/mol。 研究金屬離子對(duì)堿性NAGase的影響。結(jié)果表明：低濃度(1～10 mmol/L)的Na+和K+對(duì)酶活力沒(méi)有影響。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、高濃度(0.1～1 mol/L)的Na+和K+對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用。Zn2+、Ca2+、

5、高濃度的Na+和K+對(duì)酶的抑制都表現(xiàn)為可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，高濃度的Na+和K+對(duì)酶的抑制常數(shù)KI分別為0.47mol/L和0.32mol/L；Zn2+對(duì)酶的抑制常數(shù)KI為3.27 mmol/L；Ca2+對(duì)酶的抑制常數(shù)KI為65.28 mmol/L。 在特定濃度范圍內(nèi)，果糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖對(duì)堿性NAGase活力有不同程度的抑制作用。D-甘露糖對(duì)酶的抑制表現(xiàn)為可逆競(jìng)爭(zhēng)性類型，它的抑制常數(shù)KI為18.36 mm

6、ol/L。N-乙酰-D-氨基葡萄糖對(duì)酶的抑制類型是可逆混合型抑制類型，抑制常數(shù)KI與KIS分別為16.98 mmol/L和55.26 mmol/L。 低濃度(2～20μg/mL)的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、氟苯尼考對(duì)堿性NAGase活力沒(méi)有影響。高濃度(0.1～1 mg/mL)的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)酶活力沒(méi)有影響。高濃度(0.1～1.5 mg/mL)的恩諾沙星和環(huán)丙沙星對(duì)酶活力有一定抑制作用。高濃度(0.2～2mg/mL)氯霉素有

7、抵抗乙醇對(duì)酶活力的抑制作用。頭孢拉定(0.5～15 mg/mL)對(duì)酶有先激活后抑制作用。 對(duì)于常用精液稀釋液的主要成分，EDTA 2Na和VitaminC對(duì)堿性NAGase活力有激活作用，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸氫鈉、葡萄糖、檸檬酸三鈉對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用，Tris對(duì)酶活力的抑制作用最強(qiáng)，表現(xiàn)為可逆非競(jìng)爭(zhēng)性類型，抑制常數(shù)為9.81 mmol/L。青霉素鉀、硫酸鏈霉素和L-半胱氨酸對(duì)酶活力沒(méi)有影響。 研究