茶氨酸生物合成：基因工程菌構(gòu)建及其誘導(dǎo)合成條件.pdf

1、茶氨酸(Theanine)不僅是茶葉中的特征氨基酸，而且是茶湯特殊風(fēng)味和鮮爽味的主要成分，是評(píng)價(jià)高級(jí)綠茶的重要標(biāo)志。同時(shí)，大量研究和臨床試驗(yàn)表明茶氨酸具有促進(jìn)大腦功能和神經(jīng)的生長(zhǎng)、抗腫瘤、降壓安神等功效。居于以上特點(diǎn)，其制備研究在目前的茶學(xué)研究中逐漸成為一個(gè)熱點(diǎn)。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本較高；化學(xué)合成茶氨酸工藝較復(fù)雜；組織培養(yǎng)合成茶氨酸產(chǎn)量低.開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本論文將生物技術(shù)運(yùn)用到天然產(chǎn)

2、物制備技術(shù)中，開展了工程菌構(gòu)建方面工作。本論文通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了工程菌，優(yōu)化了工程菌催化合成茶氨酸的條件，從而達(dá)到提高茶氨酸產(chǎn)量的目的。主要研究結(jié)果如下： 1、以培養(yǎng)好的Escherichia coli DH5a(Ecoli DH5a)菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因片斷和載體pUC19，相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-GGT，將重組質(zhì)粒pUC19-GGT轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a中，構(gòu)建工程菌。工程

3、菌株經(jīng)0.1 mM IPTG在32℃誘導(dǎo)后，經(jīng)酶活性檢測(cè)，工程菌株每克濕菌體的酶活達(dá)到0.236 U/mL友右，約是出發(fā)菌株Ecoli DH5a的2.6倍。工程菌經(jīng)32℃培養(yǎng)6h左右，然后再加IPTG至0.1mM于32℃誘導(dǎo)表達(dá)4h收集菌體。1mL反應(yīng)體系(含0.35ML-谷氨酰胺、2.0 M鹽酸乙胺、70 mg/mL菌體、pH9.5)于30℃培養(yǎng)4h，茶氨酸的最大生成量為0.475g/L左右。 2、以培養(yǎng)好的熒光假單胞的菌液為

4、模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的谷氨酰胺合成酶基因片斷和載體pET32a，相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GS，將重組質(zhì)粒pET-GS轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21中，構(gòu)建工程菌.工程菌株經(jīng)0.1 mM IPTG在28℃誘導(dǎo)后，經(jīng)酶活性檢測(cè)，工程菌株濕菌體的酶活達(dá)到41.70 U/mgprot左右，約是出發(fā)菌株E.coli BL21的126.5倍。 3、本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工程菌pET-GS催化合成茶氨酸的反應(yīng)條件，工程菌經(jīng)32℃培養(yǎng)6h左右，然后