鴨源雞桿菌流行株毒素蛋白GtxA表達(dá)及其部分生物學(xué)特性的研究.pdf

1、2003年巴氏桿菌科成立一個新屬——雞桿菌屬（Gallibacterium），鴨源雞桿菌（Gallibacterium anatis，G.anatis）是雞桿菌屬的代表種。人們對雞桿菌的研究可追溯至上世紀(jì)50年代，而由于其引發(fā)宿主的病癥與其他病原相似，一直沒有給出統(tǒng)一的命名。目前，部分學(xué)者認(rèn)為雞桿菌是一類條件致病性細(xì)菌，能夠在宿主體內(nèi)上呼吸道和下生殖道等部位生存。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時，雞桿菌隨即大量增殖，可能沖破其免疫屏障并損害宿主。大

2、量人工感染試驗(yàn)證明雞桿菌具有侵襲性，能夠由侵入部位擴(kuò)散到內(nèi)臟各器官。但根據(jù)目前的試驗(yàn)結(jié)果，對雞桿菌的致病機(jī)制仍然無法了解透徹。因此，大家關(guān)于雞桿菌的致病性仍然沒有統(tǒng)一的定論。2010年，丹麥學(xué)者Kristensen等首次發(fā)現(xiàn)鴨源雞桿菌的體外分泌蛋白(Gallibacterium toxinA，GtxA)，該毒素蛋白具有損傷白細(xì)胞活性和溶血活性。本課題首次開展了鴨源雞桿菌對小鼠的致病性研究;在體外原核表達(dá)了鴨源雞桿菌蛋白GtxA，并且探究

3、GtxA對雞外周血淋巴細(xì)胞的毒性影響;利用GtxA蛋白為包被抗原，建立抗GtxA蛋白間接ELISA方法，并在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
　　1.鴨源雞桿菌對小鼠的致病性試驗(yàn)
　　為了解鴨源雞桿菌對小鼠的致病性，將實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定并保存的8株鴨源雞桿菌分別腹腔注射小鼠，觀察小鼠攻毒后的反應(yīng)及病癥變化。結(jié)果表明本研究8株受試鴨源雞桿菌株中，同一CFU的不同菌株呈現(xiàn)出不同的致病力，其中YU-PDS-RZ-1-SLG株細(xì)菌毒力較強(qiáng)。攻

4、毒死亡的小鼠各組織器官出現(xiàn)明顯的敗血癥的病變，肝、脾尤為突出，其次為腸道，心、肺等器官病變不明顯。其中YU-PDS-RZ-1-SLG株、YU-XX-HJ-4-SLG株和SHAN-XY-1-GZ株引起的致肝、脾臟病變較為嚴(yán)重。結(jié)果顯示出從感染母雞輸卵管中分離出的鴨源雞桿菌毒力強(qiáng)于從其他臟器分離出的菌株，表明鴨源雞桿菌的毒力強(qiáng)弱可能與其臟器的不同分離部位有關(guān)。
　　2.鴨源雞桿菌GtxA體外表達(dá)與其對雞外周血淋巴細(xì)胞的毒性作用

5、　　為了解鴨源雞桿菌毒素蛋白GtxA的毒力作用，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)重組蛋白GtxA、該蛋白的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。體外重組蛋白經(jīng)過活性鑒定后作用到雞外周血淋巴細(xì)胞。通過MTT法檢測細(xì)胞的受損程度，表明重組蛋白不但能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖，而且表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用。N端結(jié)構(gòu)域作為獨(dú)立的元件不能表現(xiàn)毒性作用，但是能夠促進(jìn)毒素蛋白GtxA發(fā)揮毒性作用。外周血淋巴細(xì)胞在受到GtxA蛋白刺激后，使得自身細(xì)胞生長受阻，抑制細(xì)胞因子的分

6、泌。
　　3.抗鴨源雞桿菌蛋白GtxA抗體間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用
　　目前，人們認(rèn)為鴨源雞桿菌擁有多個血清型且血清型之間的交叉保護(hù)能力較差。最新發(fā)現(xiàn)的毒力蛋白GtxA可能存在多個血清型之間。將體外表達(dá)的GtxA蛋白作為包被抗原，建立抗鴨源雞桿菌毒素蛋白GtxA抗體間接ELISA檢測方法。通過對2013年河南省不同地市680份雞血清進(jìn)行抗體水平檢測，檢測出陽性樣品129份，陽性檢出率為19.06％。而用已報道的EL

7、ISA方法檢測出陽性樣品147份，陽性率為21.62％。兩種方法檢測出同為陽性的血清有125份，同時為陰性的有544份。故本文建立的方法陽性符合率為96.89％(125/129)，陰性符合率為98.73％(544/551)，總符合率為98.38％(669/680)。
　　結(jié)果顯示幾乎全部受檢雞場均出現(xiàn)G.anatis抗體陽性的情況，平均抗體陽性率為19.06％，其中鄭州地區(qū)的感染率較高。較之2011年我國部分地區(qū)鴨源雞桿菌流行情況