幽門螺桿菌與肝癌相關(guān)性及其分子機制的初步研究.pdf

1、目的：研究原發(fā)性肝癌的發(fā)生與幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)感染的相關(guān)性，并初步探討其分子機制機制。 方法： 第一部分 1、PCR和測序分析檢測肝組織幽門螺桿菌：對80例原發(fā)性肝癌行手術(shù)切除的患者，取其肝癌組織和癌旁組織標本，用DNAzol提取組織DNA，采用巢式PCR方法，擴增螺桿菌屬特異的16SrRNA基因，30例正常肝組織為對照組。對螺桿菌16SrRNA基因擴增陽性的標本送測序，測序結(jié)果與來自GenBank中的

2、其它種屬螺桿菌序列進行同源性比較，進一步以H.pylori(基因號AF302106)相應(yīng)序列為基礎(chǔ)，用BioEdit軟件對所擴增的DNA序列進行比較分析。繼而取巢式PCR擴增陽性，來源于不同患者的癌組織或癌旁組織的標本DNA，PCR擴增幽門螺桿菌特異26Kda蛋白基因和4個相關(guān)功能基因(cagA、vacA、rps4、glmM)，以進一步確定檢出的細菌為幽門螺桿菌。2、免疫組化技術(shù)檢測肝組織幽門螺桿菌：以兔抗幽門螺桿菌抗體，通過免疫組化技

3、術(shù)，檢測80對肝癌及癌旁組織標本。 第二部分 1、幽門螺桿菌對Hep62肝細胞增殖的影響：采用不同量的幽門螺桿菌(國際標準株NCTC11637)作用于HepG2肝細胞，CCK-8法檢測細胞的增殖情況并確定最佳的幽門螺桿菌作用劑量。2、應(yīng)用Affymetrix人類基因表達譜芯片檢測幽門螺桿菌對HepG2細胞基因表達譜的影響，并應(yīng)用RT-PCR半定量技術(shù)驗證部分基因芯片的檢測結(jié)果。 第三部分 1、幽門螺桿菌感染與原發(fā)性肝細胞

4、癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。2、免疫組化技術(shù)檢測Transgelin在高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移肝癌組織中的表達差異；3、免疫組化技術(shù)檢測整合素(integrin)在高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移肝癌組織中的表達差異。 結(jié)果： 第一部分 80例肝癌患者中有57例在癌組織和/或癌旁組織中檢出螺桿菌基因，檢出率為71.25％。39份癌組織標本檢出螺桿菌基因，陽性率為48.75％， 38份癌旁組織標本檢出螺桿菌基因，陽性率為47.5％。正常肝組未檢出螺桿菌基因。

5、與癌組織和癌旁組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對57位螺桿菌16S rRNA基因陽性患者的基因擴增產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果顯示與H.pyIori同源性最高，均超過99％；同時對此57份標本DNA進行幽門螺桿菌特異基因的擴增，結(jié)果顯示能檢出5種幽門螺桿菌基因中致少1種的共有48份，檢出率84.21％。26KDa基因陽性率77.19％(44/57)，cagA基因陽性率21.05％(12/57)，glmM基因陽性率17.5％(10/57)

6、：多次擴增均未檢出vacA基因和rps4基因。這些結(jié)果證實檢測出的螺桿菌為幽門螺桿菌。免疫組化結(jié)果顯示：80例肝癌患者中有39例在癌組織和/或癌旁組織中觀察到了彎曲狀或桿狀的幽門螺桿菌存在，檢出率為48.75％。癌組織標本免疫組化陽性率為32.5％，癌旁組織標本陽性率為30.0％。正常肝組織中未觀察到了幽門螺桿菌的存在，與癌組織和癌旁組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P(0.01)。免疫組化陽性的標本PCR結(jié)果全陽性。細菌主要位于肝竇內(nèi)，亦有些位于

7、匯管區(qū)內(nèi)。 第二部分 MOI比值(細菌與細胞的個數(shù)比)在0.15:1～0.075:1時，幽門螺桿菌對HepG2細胞具有明顯的促增殖作用。表達譜基因芯片結(jié)果提示，HepG2細胞經(jīng)-定濃度(MOI比值為0.15:1)幽門螺桿菌處理后35個基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化(上調(diào)19個，下調(diào)16個)，其中與細胞骨架/基質(zhì)有關(guān)的基因6個，DNA結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子8個、細胞因子2個。選定其中的5個基因采用RT-PCR法檢測相關(guān)基因的表達，與表達譜芯片檢測

8、結(jié)果完全吻合。 第三部分高侵襲性組原發(fā)性肝細胞癌的幽門螺桿菌16s rRNA陽性率顯著高于低侵襲性組(分別為86.44％和58.06，P<0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示幽門螺桿菌16s rRNA陽性的原發(fā)性肝癌標本中Transgelin及Integrin α2的表達水平均顯著高于16s rRNA陰性標本。 結(jié)論： 1、肝癌組織內(nèi)存在幽門螺桿菌，幽門螺桿菌的感染與原發(fā)性肝癌可能存在某種相關(guān)性。 2、一定劑