棉花腺體形成時(shí)期相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、植物次生代謝物質(zhì)的有無及含量與其貯藏器官－腺體（或腺毛）的有無及多少密切相關(guān)。了解次生代謝物質(zhì)貯藏器官發(fā)生與形成的基因網(wǎng)絡(luò)及及其調(diào)控機(jī)制，能為實(shí)踐中有效的調(diào)控植物次生代謝提供理論依據(jù)。其中，棉屬植物的棉酚與其貯藏器官腺體（gland）是研究次生代謝工程較理想的一個(gè)研究模式。
　　棉酚（Gossypol）為錦葵科棉族(Gossypieae)植物特有，存在于色素腺體（pigment gland）中，是棉花自身重要的抗性物質(zhì)，但由于棉酚

2、對(duì)人類和單胃動(dòng)物有毒，限制了豐富的棉籽蛋白及油脂資源的利用。為有效調(diào)控棉酚合成，極有必要對(duì)色素腺體形成的分子機(jī)制進(jìn)行研究。
　　本論文的研究首先以“湘棉18”特殊腺體為材料（種子無腺體，植株有腺體，種子萌發(fā)過程中腺體逐漸增多。），構(gòu)建了其腺體形成時(shí)期的均一化全長 cDNA文庫。其次，選用湘棉18，川2082（種子、植株都有腺體），無腺體棉－顯無N5（種子、植株都無腺體）為材料，利用不同的材料腺體差別，通過棉花基因芯片，對(duì)腺體形成時(shí)

3、期的基因進(jìn)行高通量篩選，篩選到的明顯表達(dá)變化的基因后，在所建 cDNA文庫中進(jìn)行克隆，篩選到相關(guān)基因后，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)所克隆的基因進(jìn)行功能預(yù)測，并對(duì)其展開了不同部位的時(shí)空表達(dá)研究，從而為揭示棉花腺體形成提供了重要的分子機(jī)制理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下：
　　1.湘棉18腺體形成時(shí)期均一化全長cDNA文庫構(gòu)建：
　　構(gòu)建了湘棉18腺體形成時(shí)期的均一化全長 cDNA文庫，主要采用SMART（Switching m

4、echanism at5 end of RNA transcript）技術(shù)與DSN技術(shù)(Duplex-specific nuclease)相結(jié)合的方法，即 mRNA逆轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，經(jīng)均一化處理后，Sfi I酶切，連接在質(zhì)粒載體，電轉(zhuǎn)化，最后獲得5.86×105個(gè)獨(dú)立克隆，重組率高達(dá)94％，插入片段的平均長度約為1.4 kb，從而成功建立棉花腺體形成相關(guān)基因的cDNA文庫。通過均一化文庫的建立，使文庫中高豐度基因拷貝數(shù)有了很大程度的

5、降低，而低豐度基因的豐度得到相對(duì)提升，從而大大增加了從文庫中克隆發(fā)現(xiàn)新基因的概率。
　　2．棉花腺體發(fā)育過程中的基因表達(dá)變化的高通量分析
　　為了對(duì)棉花腺體形成提供更多信息，本研究利用高通量的方法分析了棉花腺體形成過程中的基因表達(dá)變化。采用包含大約23,977個(gè)基因探針的Affymetrix棉花基因芯片，以湘棉18突變體、野生棉（川2802）、無腺體棉（顯無N5）為研究材料，對(duì)腺體形成過程中差異表達(dá)的基因進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示

6、，在腺體形成過程中，湘棉18腺體形成時(shí)、湘棉18腺體形成前、無腺體棉N5三種材料中的共同有差異表達(dá)的基因311條，其中112條上調(diào)，191條下調(diào)；川（2802）、湘棉18腺體形成前、無腺體棉N5的共同差異表達(dá)的基因有549條，其中218條上調(diào)，331條下調(diào)。上述基因主要涉及蛋白質(zhì)聚合、微管運(yùn)動(dòng)、脂類合成、氨基酸磷酸化、代謝途徑調(diào)控的酶基因、受外界脅迫表達(dá)的抗逆相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等以及其它一些未知功能的基因。接著采用

7、RT-PCR驗(yàn)證了其中6個(gè)基因，均與芯片結(jié)果一致。從中可以推測，腺體的形成是多因素多基因共同作用的結(jié)果，它們通過相互調(diào)節(jié)并形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而直接或間接地導(dǎo)致腺體的形成。
　　3．棉花腺體形成相關(guān)的基因GRP1的克隆和分析
　　從基因芯片篩選的與腺體形成相關(guān)的基因中，選取 DW513956設(shè)計(jì)引物，對(duì)均一化全長文庫進(jìn)行PCR篩選，獲得全長序列，命名為GRP1（GeneBank收錄號(hào)：EU3703012）。GRP1基因全長為12

8、03 bp的cDNA序列，開放閱讀框起始位點(diǎn)為25bp處，終止位點(diǎn)為771bp處，編碼248個(gè)氨基酸。蛋白分子量為33.09 KD，理論等電點(diǎn)pI為8.99，亞細(xì)胞定位在胞質(zhì)內(nèi)，GRP1屬于疏水分泌性蛋白質(zhì)，有一個(gè)信號(hào)肽，具分泌型過氧化物酶的保守區(qū)域。與煙草的過氧化物酶，紅豆的過氧化物酶，大戟等的相似度較高，分別為75%，75%，73%。
　　對(duì)GRP1基因，進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交的方法分析其表達(dá)的具體部位，從分子水平研究腺體形成的機(jī)

9、理，發(fā)現(xiàn)其mRNA的表達(dá)主要集中在植株的纖維化程度高的部位，如導(dǎo)管、厚壁細(xì)胞等位置，在薄壁細(xì)胞處表達(dá)量少。
　　4.腺體形成相關(guān)的基因GRP2的克隆和分析和的進(jìn)一步分析
　　從基因芯片篩選的與腺體形成相關(guān)的基因中，選取 DT463838進(jìn)行了深入分析。首先對(duì)均一化全長文庫進(jìn)行PCR篩選，獲得全長序列，命名GRP2（GeneBank收錄號(hào)：EU3703033）。GRP2基因全長為1989 bp的cDNA序列，起始位點(diǎn)為135b