一個先天性遺傳性白內(nèi)障家系的致病基因及蛋白質(zhì)功能改變的研究.pdf

1、先天性白內(nèi)障是指出生后第一年發(fā)生的晶狀體部分或全部混濁。我國群體發(fā)病率為0.05％，在歐美國家兒童發(fā)病率為0.01-0.06％，新生兒發(fā)病率為0.022-0.0249％。先天性白內(nèi)障占兒童失明原因的第二位，全世界約10％盲童因而致盲。遺傳和宮內(nèi)感染等諸多因素都可引起先天性白內(nèi)障。遺傳性白內(nèi)障占先天性白內(nèi)障的比例可達25％。先天性白內(nèi)障具有明顯的臨床和基因異質(zhì)性，臨床上先天性白內(nèi)障可表現(xiàn)為核性、前極、后極等形態(tài)各異的晶狀體混濁。從遺傳學角

2、度，先天性白內(nèi)障又可表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，常染色體隱性遺傳和伴性連鎖遺傳。除此之外，一些先天性白內(nèi)障還可合并其他系統(tǒng)的疾患，以綜合征的形式表現(xiàn)出來。
　　先天性白內(nèi)障無論從臨床表現(xiàn)還是從遺傳基因角度均存在明顯的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性表現(xiàn)為不同致病基因決定同一臨床表型，而同一基因的相同突變卻可引起不同的疾病表型。正是由于這種異質(zhì)性的存在，表型與基因型之間的關(guān)系又是有限的，每種致病基因突變所導致的白內(nèi)障占全部遺傳性白內(nèi)障的比例都很小，所

3、以目前仍有多個未知致病基因有待發(fā)現(xiàn)，先天性白內(nèi)障的臨床及分子發(fā)病機制尚未完全了解。
　　論文的第一部分我們通過基因序列分析的方法對一個常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系進行突變篩查，對家系患者進行詳細的臨床檢查，排除眼部及仝身其他疾患。提取家系成員外周血DNA，根據(jù)家系特征性的前極Y字縫晶體核性混濁的臨床表型，對與該臨床表型關(guān)系最為密切的致病基因CRYGD，CRYGC，設(shè)計相關(guān)引物，經(jīng)PCR擴增目的條帶后，直接測序。結(jié)果在CRYG

4、D基因第3外顯子第452堿基處發(fā)現(xiàn)了插入突變，c.452InsGACT，插入的四個堿基直接導致了堿基的移碼，編碼的相應(yīng)蛋白第151位酪氨酸變?yōu)榻K止密碼，蛋白轉(zhuǎn)錄的提前終止。根據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫，排除單核苷酸多態(tài)性。檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，確定此改變?yōu)镃RYGD基因未見報道的新突變。對家系內(nèi)所有成員以及100個無關(guān)健康個體進行驗證，結(jié)果表明所有健康個體均不攜帶該突變

5、，明確了基因型和臨床表型之間的關(guān)系。迄今為止，關(guān)于CRYGD基因的相關(guān)報道大多數(shù)為單堿基的錯義突變（包括R15C，P24T，R37S，R59H，E107A，W157X等），目前僅有一例報道為單堿基的缺失造成移碼突變(G165fs)。我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)了因為CR YGD基因的堿基插入所導致的移碼突變。為先天性白內(nèi)障的基因診斷提供依據(jù)。
　　論文的第二部分在發(fā)現(xiàn)家系致病基因CRYGD Tyr151X的基礎(chǔ)上，運用克隆技術(shù)，利用人類多

6、組織cDNA文庫卵巢組織，克隆CRYGD的野生型質(zhì)粒。利用PCR介導的定點突變技術(shù)，克隆突變型質(zhì)粒。在完成表達載體構(gòu)建后，對重組表達載體進行了測序，測序的結(jié)果顯示野生型和突變型重組表達載體都表達成功，這為分析突變所致白內(nèi)障分子機理的研究提供了基礎(chǔ)。利用Swiss-modelSoftware(Version3.7)、 Expasy、Radar等網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)軟件，分析CRYGD基因突變型和野生型，把野生型和突變型的DNA序列信息分析的源頭，利

7、用基因組編碼區(qū)的信息進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的模擬和蛋白質(zhì)功能的預測。可能從以下幾個方面的變化，導致白內(nèi)障的發(fā)生:1、突變后等電點的變化影響晶狀體細胞內(nèi)的PH值。生理條件下晶狀體細胞內(nèi)PH值為7.0，野生型的CRYGD等電點也為7.0，這意味著CRYGD蛋白將不帶電荷，均勻的分布在晶狀體纖維細胞中，從而保持晶狀體的透明性;突變后，等電點下降為6.05，影響晶狀體蛋白電荷性質(zhì)，蛋白質(zhì)間異常的靜電作用，可能會使其相互聚集，產(chǎn)生沉淀，影響晶狀體蛋白

8、的正常排列，導致白內(nèi)障的產(chǎn)生。2、功能結(jié)構(gòu)域變短突變使轉(zhuǎn)錄提前終止，第四個晶體結(jié)構(gòu)蛋白Greek Key序列129-171提前終止，缺失24個氨基酸，整個CRYGD蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域變短，可能影響到蛋白質(zhì)的正確折疊。3、蛋白質(zhì)的內(nèi)部的重復性的變化目前認為蛋白質(zhì)內(nèi)部重復片段在蛋白質(zhì)序列進化的過程中具有重要意義，許多大的蛋白質(zhì)通過內(nèi)部復制進行進化，所以蛋白質(zhì)內(nèi)部的重復性與其功能和內(nèi)部結(jié)構(gòu)單位相關(guān)。Tyr151X突變使得蛋白質(zhì)的內(nèi)部的重復性發(fā)

9、生改變，可能進而影響到蛋白質(zhì)的功能。4、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化將CRYGD及其突變序列分別輸入Swiss-model，數(shù)據(jù)庫將序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行匹配，輸回三維圖像。從三維結(jié)構(gòu)上看，突變后該蛋白缺失了一個alpha螺旋和一段beta折疊，屬于非常劇烈的突變?？梢灶A計突變后立體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很可能生物學功能也將喪失。
　　為了進一步研究CRYGD基因突變導致先天性白內(nèi)障的分子機制，論文的第三部分中運用基因工程技術(shù)

10、，在真核細胞中分別表達外源性CRYGD正常和突變型質(zhì)粒，對其蛋白的表達定位和抗凋亡功能等進行研究，結(jié)果顯示，野生型CRYGD蛋白在胞漿和細胞核中均有表達，突變型CRYGD蛋白在細胞核中表達且分布得很不均勻，呈顆粒聚積狀態(tài)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的293T細胞更容易凋亡。在Western Blot實驗中野生型細胞蛋白全部在裂解的細胞上清中表達，而沉淀物中未見任何表達，而突變型只有少部分在裂解的細胞上清中表達，大部分在沉淀物

11、中表達;野生型所表達的蛋白片段大小基本與CRYGD大小一致，而突變型所表達的蛋白片段有所變小;提示突變可能使基因的轉(zhuǎn)錄提前終止，CRYGD蛋白變小，溶解度降低。
　　研究結(jié)果表明：
　　1、在對一常染色體顯性遺傳Y字縫型先天性白內(nèi)障家系的致病基因研究中發(fā)現(xiàn)了CRYGD基因的一個新的突變位點——Tyr151X。這是迄今為止有關(guān)CRYGD基因所致突變中唯一的插入所導致的移碼突變。
　　2、成功構(gòu)建了CRYGD基兇的野生型和