坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起大鼠神經(jīng)病理性疼痛及其機(jī)制.pdf

1、周?chē)窠?jīng)損傷常常會(huì)引起神經(jīng)病理性疼痛，主要表現(xiàn)為痛超敏，即痛閾下降；痛覺(jué)過(guò)敏，即痛反應(yīng)增強(qiáng)和自發(fā)性疼痛。但迄今為止，神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制仍然不清楚。 最近的研究表明炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。抑制TNF-α的合成或拮抗其受體可減輕神經(jīng)病理性疼痛。坐骨神經(jīng)內(nèi)注射低劑量的TNF可以引起大鼠機(jī)械性痛閾下降和熱痛反應(yīng)增強(qiáng)，持續(xù)

2、時(shí)間為幾天。但是，TNF-α在體內(nèi)的半衰期只有十幾分鐘，注射一次生理濃度的TNF-α為什么會(huì)引起如此長(zhǎng)時(shí)間的病理性疼痛還不是很清楚。 以前的研究表明神經(jīng)損傷可導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)(DRG)TNF-α及其受體1(TNFreceptor 1，TNFR1)的增加，而且許多表達(dá)有TNF-α的神經(jīng)元同時(shí)表達(dá)有大量的TNFR1。這提示TNF-α可能是通過(guò)自分泌途徑以引起神經(jīng)病理性疼痛。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)周?chē)o予10，100，1000 p

3、g/ml重組大鼠腫瘤壞死因子(rrTNF，recombinant rat TNF-α，每天一次，共2天)可引起大鼠雙側(cè)后爪機(jī)械性痛閾下降和熱痛反應(yīng)增強(qiáng)，即鏡像痛，持續(xù)約20天。然后在坐骨神經(jīng)周?chē)┘?00 pg/ml rrTNF(Peri-sciatic administration ofrrTNF，以下簡(jiǎn)稱(chēng)PST)后不同時(shí)間點(diǎn)，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了L4，L5 DRG及腰膨大脊髓背角TNF-α及其受體1的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同側(cè)(非對(duì)

4、側(cè))L4，L5 DRG TNF-α及其受體1的免疫活性分別于給藥后第1，3天增高。免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)增高的TNF-α免疫活性主要位于DRG的神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星細(xì)胞，而受體1主要位于神經(jīng)元。腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α免疫活性第3天開(kāi)始顯著增加，一直持續(xù)到第14天，位于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。TNFR1免疫活性在給藥后一直未發(fā)生顯著變化。另外，我們還發(fā)現(xiàn)PST后6天，同側(cè)L4，L5 DRG內(nèi)Nav1.3表達(dá)顯著增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)最后還觀(guān)察到PST前30

5、分鐘，鞘內(nèi)注射N(xiāo)F-kB抑制劑PDTC可完全抑制rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏及TNF-α，TNFR1的表達(dá)增高。這些結(jié)果提示外源性的低劑量TNF-α可能是通過(guò)自分泌途徑，也就是說(shuō)可能是通過(guò)先作用于感覺(jué)神經(jīng)元上的TNFR1，然后激活NF-kB信號(hào)通路，從而引起自身的產(chǎn)量增加以引起大鼠長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏。 第1部分坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起大鼠雙側(cè)后爪機(jī)械刺激和熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏。最近的研究表明炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α在神經(jīng)病理

6、性疼痛的產(chǎn)生過(guò)程中起作用。抑制TNF-α的合成或拮抗TNF-α的受體可以減輕病理性疼痛。大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)注射TNF可以引起機(jī)械性痛閾下降和熱痛反應(yīng)增強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間為幾天。但坐骨神經(jīng)內(nèi)膜注射也會(huì)損傷神經(jīng)。在完全沒(méi)有神經(jīng)損傷的情況下，單純外源性TNF-α是否能引起神經(jīng)病理性疼痛還不清楚。本研究擬用行為學(xué)測(cè)試的方法觀(guān)察坐骨神經(jīng)周?chē)o予重組大鼠TNF-α是否能產(chǎn)生類(lèi)似于神經(jīng)損傷以后的痛行為學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10， 100，1000 pg/ml r

7、rTNF(每天一次，共2天)可引起大鼠雙側(cè)后爪機(jī)械性痛閾下降和熱反應(yīng)增強(qiáng)，持續(xù)約20天。坐骨神經(jīng)周?chē)o予1pg/mlrrTNF后，大鼠雙側(cè)后爪50﹪機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無(wú)變化。100pg/ml組與1000 pg/ml組產(chǎn)生的機(jī)械性刺激與熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏的程度無(wú)明顯差別。坐骨神經(jīng)周?chē)o予200μl 0.1﹪BSA(rrTNF溶劑)對(duì)大鼠雙側(cè)后爪50﹪機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無(wú)任何影響。肌肉內(nèi)(靠近而不接觸坐骨神經(jīng))給予rrT

8、NF(1000 pg/ml，200 μl，每天一次，共兩天)對(duì)大鼠雙側(cè)后爪50﹪機(jī)械刺激撤足閾值和熱刺激潛伏期無(wú)影響。上述結(jié)果提示在完全不損傷神經(jīng)的情況下，坐骨神經(jīng)周?chē)o予低劑量的rrTNF可通過(guò)神經(jīng)途徑而不是血液途徑引起神經(jīng)病理。 第2部分坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起TNF-α及TNFR1在背根神經(jīng)節(jié)和TNF-α在脊髓背角的表達(dá)增高。本實(shí)驗(yàn)第一部分已經(jīng)觀(guān)察到rrTNF可引起大鼠雙側(cè)后爪機(jī)械痛閾下降和熱刺激反應(yīng)增強(qiáng)。以前有實(shí)驗(yàn)

9、報(bào)道向坐骨神經(jīng)施加TNF-α可引起Aδ纖維和C纖維的自發(fā)放電。離體時(shí)TNF可引起正常DRG神經(jīng)元短時(shí)間放電。很明顯細(xì)胞因子對(duì)痛覺(jué)傳導(dǎo)通路中神經(jīng)元的急性興奮作用在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生中起作用。然而，TNF-α的半衰期只有十幾分鐘，如此低劑量的rrTNF是如何引起長(zhǎng)達(dá)20天的神經(jīng)病理性疼痛的呢?以前的研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)腰5前根切除以選擇性的損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維而不損傷感覺(jué)神經(jīng)元，也可以使大鼠產(chǎn)生雙側(cè)后爪神經(jīng)病理性疼痛的行為學(xué)變化，同側(cè)L4和L5 DR

10、G及雙側(cè)腰五脊髓背角的TNF-α及TNFR1明顯增高。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)DRG的大多數(shù)神經(jīng)元表達(dá)有過(guò)量TNF-α的同時(shí)也表達(dá)有大量TNFR1。這提示TNF-α可能通過(guò)自分泌途徑以發(fā)揮作用。因此在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谑┘?00 pg/ml rrTNF后不同時(shí)間點(diǎn)，用免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙染的方法檢測(cè)L4，L5 DRG及脊髓背角TNF-α及其受體1的表達(dá)情況和細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PST可引起TNF-α及其受體l在同側(cè)L4，L5 DRG和

11、TNF-α在腰膨大雙側(cè)脊髓背角的增高。在DRG，與對(duì)照組相比，PST后1天，TNF-α的免疫活性開(kāi)始增高，3天時(shí)其受體1的免疫活性開(kāi)始增高，6天時(shí)達(dá)到高峰，顯著性差異可維持2周左右。免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)增多的TNF-α主要位于神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星細(xì)胞，而受體1的上調(diào)僅局限于神經(jīng)元。在脊髓，PST后3天，腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α免疫活性陽(yáng)性面積百分比顯著增加，維持至第14天。免疫雙染發(fā)現(xiàn)TNF-α的上調(diào)既可見(jiàn)于膠質(zhì)細(xì)胞，也可見(jiàn)于神經(jīng)元。以

12、上結(jié)果說(shuō)明外源性TNF-α可引起TNF-α及其受體1的增多，也就是說(shuō)坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF可能是通過(guò)自分泌途徑引起病理性疼痛的。 第3部分NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起痛覺(jué)過(guò)敏中的作用。TNF-α與其受體1結(jié)合以后，主要通過(guò)激活NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以發(fā)揮作用。在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先觀(guān)察了NF-kB的抑制劑，PDTC對(duì)rrTNF引起機(jī)械性痛敏和熱痛敏的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每次坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF前3

13、0分鐘鞘內(nèi)注射PDTC(8.2 ng/10μl)可完全防止大鼠雙側(cè)后爪50﹪機(jī)械刺激撤足閾值的下降，而熱刺激撤足潛伏期的下降也顯著延遲；相反的，第一次坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后6天，再鞘內(nèi)給予同等劑量的PDTC對(duì)已經(jīng)形成的機(jī)械性痛敏無(wú)作用，對(duì)熱痛敏卻有短暫的抑制作用，鞘內(nèi)注射生理鹽水對(duì)rrTNF引起機(jī)械痛敏和熱痛敏無(wú)顯著影響。PST前給予PDTC可能是通過(guò)抑制TNF-α及TNFR1的增高以阻止機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生的，因此我們進(jìn)一步在6

14、只PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC的大鼠上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此組大鼠L5 DRG的TNF-α，TNFR1免疫活性和脊髓的TNF-α免疫活性均顯著下降。此結(jié)果提示TNF-α與NF-kB之間的正反饋可能在rrTNF引起的大鼠機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生中起重要作用。外源性TNF-α僅通過(guò)激活NF-kB以引起內(nèi)源性的TNF-α增加從而引起神經(jīng)病理性疼痛。 結(jié)論： 1.在完全不損傷神經(jīng)的情況下，坐骨神經(jīng)周?chē)o予低劑量的重組大鼠腫瘤壞

15、死因子-α可引起大鼠雙側(cè)后爪機(jī)械刺激和熱刺激痛覺(jué)過(guò)敏，持續(xù)約20天。(我們把這一模型命名為PST模型)2. PST可引起TNF-α，TNFR1在同側(cè)L4，L5 DRG以及TNF-α在腰膨大雙側(cè)脊髓背角的表達(dá)增高。 3.PST引起的TNF-α表達(dá)增強(qiáng)，在DRG主要位于神經(jīng)元，少量位于衛(wèi)星樣膠質(zhì)細(xì)胞，在脊髓背角也發(fā)現(xiàn)于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。但TNFR1的上調(diào)僅存在于DRG神經(jīng)元。 4.PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC可完全防止r

16、rTNF引起機(jī)械性痛閾下降，而PST后6天給予同等劑量的PDTC對(duì)已經(jīng)形成的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏無(wú)作用。說(shuō)明NF-kB途徑的激活可能在大鼠機(jī)械刺激痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生過(guò)程中起作用，而在維持中不起作用。 5.PST前30分鐘鞘內(nèi)給予PDTC可顯著降低rrlNF所引起L5 DRG TNF-α，TNFR1的增高，及腰膨大雙側(cè)脊髓背角TNF-α的增高。 6.TNF-α可能是通過(guò)自分泌途徑，也就是說(shuō)TNF-α可能是作用于感覺(jué)神經(jīng)元上持續(xù)表達(dá)的