一株HTLV-1病毒全基因組測(cè)序分析.pdf

1、背景與目的：
　　人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(Human T-cell lymphotropic virus，HTLV)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的感染人的逆轉(zhuǎn)錄病毒。它存在有兩個(gè)亞型即HTLV-1和HTLV-2，它們之間在基因上的同源性高達(dá)70％。HTLV-2主要報(bào)道是愛斯基摩人感染;人T嗜淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)是一種能持續(xù)感染人類的外源性反轉(zhuǎn)錄病毒。在世界范圍內(nèi)，受其感染的包括日本、赤道附近非洲地區(qū)、加勒比海地區(qū)及南美洲地區(qū)約有1-2千

2、萬人;我國(guó)的東南沿海地區(qū)，如廣州、福建等地也存在小流行區(qū)。這種病毒的傳播途徑包括母嬰垂直傳播、性傳播、共用針頭傳播和污染血產(chǎn)品傳播。當(dāng)人一旦被HTLV-1感染后，病毒能夠在人體內(nèi)長(zhǎng)期存在，潛伏期可長(zhǎng)達(dá)20年以上，并可在多年后引起白血病或下肢癱瘓等致死或致殘性疾病。目前尚未研發(fā)出行之有效的治療藥物和病毒預(yù)防疫苗。
　　由于我國(guó)東南沿海地區(qū)存在一定數(shù)量的感染人群，又加之隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展國(guó)內(nèi)人口流動(dòng)行的加劇，以及HTLV-1傳播的特點(diǎn)和輸

3、血篩查項(xiàng)目的缺失。因而HTLV-1有可能在國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)非流行區(qū)造成更多的感染者出現(xiàn)。為了深入探索我國(guó)傳統(tǒng)非流行區(qū)感染HTLV-1病毒基因的分子特征，我們?cè)诤幽虾贝笠?guī)模HTLV-1調(diào)查的基礎(chǔ)上，對(duì)獲得的一株HTLV-1病毒的全基因進(jìn)行了測(cè)序和分析。
　　方法：
　　1.標(biāo)本的ELISA檢測(cè):取100份健康人血清標(biāo)本和在湖北大規(guī)模HTLV-1調(diào)查得到的6份人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒(HTLV)抗體檢測(cè)陽性的血清標(biāo)本，使雙抗原夾心酶聯(lián)

4、免疫法檢測(cè)復(fù)檢。
　　2.WB鑒定:雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)陽性的6份標(biāo)本，再使用新加坡MPBiomedicals Asia Pacific Pte.Ltd公司生產(chǎn)的MP Diagnostics(MPD)HTLVBLOT2.4的WB鑒定試劑檢測(cè)。
　　3.HTLV-1前病毒DNA分段擴(kuò)增克隆和測(cè)序:提取HTLV-1陽性淋巴細(xì)胞得到的含有HTLV-1前病毒DNA的基因組，使用9對(duì)HTLV-1分段擴(kuò)增引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到

5、9個(gè)相互重疊的HTLV-1片段;用T4連接酶使9個(gè)片段分別與T載體重組連接;采用PCR擴(kuò)增和NcoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組子;采用Sanger雙脫氧終止法進(jìn)行正反雙向測(cè)序鑒定;測(cè)得的DNA序列采用Sequencher軟件3.1版(Genecodes，inc.，AnnArbor,MI，USA)進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)HTLV-1前病毒基因組DNA序列。
　　4.分離株HTLV-1基因和蛋白進(jìn)化樹分析。
　　結(jié)果：
　　1.雙

6、抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果顯示，100份健康人血清標(biāo)本均陰性;初檢陽性的血清標(biāo)本6份有5份陽性，1份位于臨界值。
　　2.使用新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd公司生產(chǎn)的MP Diagnostics(MPD)HTLV BLOT 2.4的WB鑒定試劑進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)，結(jié)果得到1例HTLV-1標(biāo)本。
　　3.HTLV-1前病毒DNA分段擴(kuò)增結(jié)果:HTLV-1分段擴(kuò)增得到1150bp的第一片段

7、、1149bp的第二片段、1135bp的第三片段、1087bp的第四片段、1045bp的第五片段、1050bp的第六片段、1136bp的第七片段、1148bp的第八片段和960bp第九片段，各片段大小與預(yù)計(jì)一致。
　　4.PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果顯示9個(gè)片段均得到插入的陽性克隆。
　　5.9個(gè)重組克隆均能被NcoⅠ和SalⅠ雙酶切下對(duì)應(yīng)的插入序列，切下的插入序列的片段長(zhǎng)度也與設(shè)計(jì)一致。
　　6.全長(zhǎng)HTLV-1前病毒基因組D

8、NA序列（GenBank數(shù)據(jù)庫編號(hào)為KC807984）全長(zhǎng)9034bp，其中“A”2088個(gè)占23.11％，“C”3159個(gè)占34.96％，“G”1707個(gè)占18.89％，“T”2080個(gè)占23.02％。其中，1-756位為5'端LTR區(qū);803-2092位為gag蛋白編碼區(qū);2499-5188位為pol蛋白編碼區(qū);5125-7128位為rex蛋白編碼區(qū);5181-8360位為tax蛋白編碼區(qū);5181-6647位為env蛋白編碼區(qū);8

9、279-9304位為3'端LTR區(qū)。
　　7.HTLV-1分離株KC807984全基因組進(jìn)化分析結(jié)果顯示，其仍屬A組，親緣關(guān)系最近的是中國(guó)重慶分離株AF259264，它們基因序列同源性高達(dá)99.72％;與日本的幾個(gè)分離株(U19949，J02029，AB513134)同源性次之;與所羅門群島分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，于中非分離株次之。
　　結(jié)論：
　　HTLV-1分離株KC807984全基因組9034bp，基因亞型屬A組，與