白菜春化相關(guān)基因BcFLC的克隆與功能分析.pdf

1、蕓薹屬(Brassica)蔬菜是我國栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的一類蔬菜作物。其中白菜(Brassica　campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis)類蔬菜絕大部分屬于冬性一年生蔬菜作物，需要經(jīng)歷一個低溫階段(春化作用)才能順利完成階段發(fā)育轉(zhuǎn)變。感溫先期抽薹是影響普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis)

2、產(chǎn)量的一個重要因素，也是生產(chǎn)上迫切需要解決的問題。因而研究普通白菜的開花習(xí)性進(jìn)而培育晚抽薹品種是解決這一問題的根本途徑。菜心(B.campestris ssp.chinensis var.parachinensis)是白菜的一個變種，它對低溫要求不嚴(yán)格，在華南地區(qū)可以周年生產(chǎn)，是代表極端早抽薹的一類白菜類作物。普通白菜和菜心具有相似的遺傳背景，對春化需求卻表現(xiàn)出巨大的差異，這為我們在白菜類蔬菜中研究春化作用提供了良好的材料。隨著分子生物

3、學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，對同為十字花科的模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)春化作用的研究已經(jīng)十分深入，這也為我們的研究提供了便利。本實驗室在前一階段實驗中利用同源基因克隆法和RACE技術(shù)，從普通白菜和菜心中克隆到了擬南芥春化核心基因FLC的同源基因BcFLC-1和BcFLC-2，以及它們的內(nèi)含子1序列。為進(jìn)一步了解BcFLC基因的功能以及普通白菜與菜心對春化需求不同的原因，我們進(jìn)而克隆了BcFLC的啟動子序列，并構(gòu)建

4、了BcFLC基因的正義和反義載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)入菜心和普通白菜中，得到了230株轉(zhuǎn)化植株，分別對它們的開花時間進(jìn)行觀察。取得結(jié)果如下： (1)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對BcFLC-1與BcFLC-2基因編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者編碼序列的一致性高達(dá)99.34％，氨基酸序列包含與開花密切相關(guān)的MADS-盒結(jié)構(gòu)域和K-盒結(jié)構(gòu)域，僅在保守區(qū)域外存在1個氨基酸的差異。兩者的內(nèi)含子1序列的相似性達(dá)91.67％，啟動子序列

5、的相似性達(dá)97.1％，表明BcFLC-1和BcFLC-2并不存在實質(zhì)性的差異。 (2)分別構(gòu)建了正義BcFLC基因以及反義BcFLC基因的組成型啟動子CaMV35S的表達(dá)載體pBI35S-BcFLC1和pBI35S-BcFLC2。檢測鑒定后分別將它們導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。 (3)根據(jù)余小林等(2002)構(gòu)建的菜心和普通白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，共獲得48個芽系的230株抗卡那霉素抗性苗。其中轉(zhuǎn)正義載體的菜心20個芽系，

6、轉(zhuǎn)化效率為3.608％，轉(zhuǎn)空載體對照的菜心2個芽系，轉(zhuǎn)化效率為1.831％，轉(zhuǎn)反義載體的普通白菜18個芽系，轉(zhuǎn)化效率為2.272％，轉(zhuǎn)空載體對照的普通白菜2個芽系，轉(zhuǎn)化效率為1.210％。以芽系為單位提取DNA，經(jīng)PCR檢測、Southern印跡雜交，所得到的再生植株中84.78％為陽性轉(zhuǎn)基因植株。 (4)觀察轉(zhuǎn)基因菜心和普通白菜的開花時間發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入正義BcFLC基因表達(dá)載體的菜心平均在分化后54 d、長出10片真葉時現(xiàn)蕾，而對