高效HDV核酶表達(dá)載體的優(yōu)化及其抑制HBV基因表達(dá)的研究.pdf

1、真核生物基因表達(dá)的調(diào)控是目前分子生物學(xué)研究中重要的前沿領(lǐng)域，形成了多個(gè)熱點(diǎn)。而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)過程中最重要的第一步，由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA之間的相互作用，以及一些復(fù)雜大分子復(fù)合物的形成導(dǎo)致真核生物的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是一個(gè)多級(jí)的復(fù)雜過程。其中，啟動(dòng)子和反式作用因子在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中起到非常重要的作用。 真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中，啟動(dòng)子對(duì)于目的基因的表達(dá)非常重要。用來進(jìn)行外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子都是根據(jù)生物體中

2、存在的啟動(dòng)子開發(fā)出來的。天然的啟動(dòng)子種類繁多，而且各具特點(diǎn)。有些啟動(dòng)單基因的轉(zhuǎn)錄，而另外一些與多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)；有些單獨(dú)啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，但也有兩個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子共同啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。盡管有很多證據(jù)表明自然界中存在雙啟動(dòng)子作用于同一基因的情況，但較少有人將其應(yīng)用于外源基因的表達(dá)。 反式作用因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中具有特殊的重要性。它是能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在順式作用元件8～12bp核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)。

3、這類DNA結(jié)合蛋白有多種，能特異性識(shí)別這類蛋白的序列也有多種，正是不同的DNA結(jié)合蛋白與不同的識(shí)別序列之間的空間結(jié)構(gòu)上的相互作用，以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)成了復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)。 乙型肝炎病毒（HBV）嚴(yán)重危險(xiǎn)人類的健康。目前廣泛采用的抗HBV治療藥物α-干擾素與核苷類似物，對(duì)清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA均無良好的效果，難以徹底清除病毒，因此都存在著不能從根本上清除體內(nèi)的乙肝病毒，停藥易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性等

4、缺點(diǎn)。所以尋找一種新的高效、低毒且能徹底清除體內(nèi)HBV的治療方法顯得十分重要。 HDV核酶是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在人體細(xì)胞具有天然裂解活性的核酶類型，它的活性發(fā)生在HDV基因組復(fù)制的中間環(huán)節(jié)。HDV的復(fù)制依賴于HBV編碼的蛋白質(zhì)，在其生活史中一直伴隨著HBV的存在。因此，研究將HDV核酶作為HBV的反義抑制劑可能有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 研究目的： 探討各種不同的雙啟動(dòng)子、單啟動(dòng)子對(duì)目的基因表達(dá)的影響；通過篩選啟動(dòng)子以及可能

5、增強(qiáng)外源基因表達(dá)的反式作用因子來優(yōu)化靶向乙型肝炎病毒的HDV核酶表達(dá)載體，探討其對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制作用。同時(shí)為后續(xù)提高表達(dá)HDV核酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的研究奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1．雙啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP載體的構(gòu)建：利用PCR方法，擴(kuò)增U2和U3啟動(dòng)子，然后應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建含有四種雙啟動(dòng)子（CMV-H1、CMV-U2、CMV-U3、CMV-U6）的pEGFP表達(dá)載體，并用PCR、酶切和測(cè)序方法鑒定重組質(zhì)粒。

6、 2．重組雙啟動(dòng)子載體的轉(zhuǎn)染和檢測(cè)：利用脂質(zhì)體法將上述重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組載體的轉(zhuǎn)染效率以及熒光指數(shù)（轉(zhuǎn)染效率與平均熒光強(qiáng)度的乘積）。 3．不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HDV核酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建：應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建含有六種不同啟動(dòng)子（CMV、H1、tRNA、U2、U3、U6）以及兩種不同HDV核酶（針對(duì)HBV序列的PreS2、C區(qū)）的pLEGFP表達(dá)載體，并用PCR、酶

7、切和測(cè)序方法鑒定重組質(zhì)粒。將重組載體利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞，并于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)。 4．含有不同反式作用因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建：利用RT-PCR方法，擴(kuò)增出GAPDH，然后應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建含有六種不同反式作用因子（β-globin、GAPDH、Mst167、Rev、Tat、X）的pL-U6-Rz表達(dá)載體，并用PCR和酶切方法鑒定重組質(zhì)粒。

8、 研究結(jié)果： 1．經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，證明成功構(gòu)建了pEGFP-H1、pEGFP-U2、pEGFP-U3、pEGFP-U6等含CMV和H1、U2、U3與U6的真核表達(dá)載體。 2．將載體pEGFP及上述重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染率分別為26．57±1．54％、28．57±0．99％、16．14±1．69％、22．63±1．77％和17．89±1．84％，熒光指數(shù)FI值分別為

9、142．79±31．26、103．59±25．90、19．67±0．52、58．164±14．58和15．40±1．92，結(jié)果顯示構(gòu)建的各雙啟動(dòng)子載體沒能提高轉(zhuǎn)染效率，也沒能增強(qiáng)EGFP的表達(dá)。 3．經(jīng)PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒，證明成功構(gòu)建了由CMV、H1、tRNA、U2、U3以及U6等不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的針對(duì)乙型肝炎病毒HBV前S2基因以及C基因的重組載體pLEGFP-CMV-S2/C，pLEGFP-H1-S2/C，pLEGFP-

10、tRNA-S2/C，pLEGFP-U2-S2/C，pLEGFP-U3-S2/C，pLEGFP-U6-S2/C。 4．將pLEGFP及上述含不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞。ELISA檢測(cè)HDV核酶對(duì)HBsAg抑制在40-85％之間，最高達(dá)到84．9％，對(duì)HBeAg抑制在6-55％之間，最高可達(dá)53．5％。 5．經(jīng)PCR和酶切鑒定重組質(zhì)粒，證明成功構(gòu)建了pL-globin-U6-S2/C，pL

11、-GAPDH-U6-S2/C，pL-Mst167-U6-S2/C，pL-Rev-U6-S/C，pL-Tat-U6-S2/C，pL-X-U6/C真核表達(dá)載體。 研究結(jié)論： 本課題成功構(gòu)建了分別含有不同雙啟動(dòng)子、單啟動(dòng)子以及反式作用因子的真核表達(dá)載體；并利用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，通過觀察綠色熒光、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等方法分析各種不同的雙啟動(dòng)子以及單啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)效果，雙啟動(dòng)子并不能提高EGFP的表達(dá)，各種