家蠶血細胞特異啟動子的篩選與鑒定.pdf

1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目模式生物，在理論研究和生產(chǎn)應用方面都具有重要作用。家蠶基因組框架圖、精細圖和全基因組表達芯片等研究工作的完成，為家蠶基因的鑒定與功能研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。家蠶血細胞在家蠶代謝、先天免疫以及發(fā)育變態(tài)等方面扮演重要角色。盡管眾多有關家蠶血細胞的相關基因已經(jīng)被初步克隆與鑒定，但如何研究和應用這些基因仍然是亟待解決的問題。家蠶轉基因關鍵理論及技術體系的構建，迫切需要家蠶血細胞特異表達啟動子作為研究工具，來實

2、現(xiàn)對家蠶血細胞的深入研究。對家蠶血細胞特異啟動子的探索有助于血細胞相關基因功能的解析以及造血調控網(wǎng)絡的深入研究，為家蠶血細胞研究體系奠定重要的理論基礎。
　　本研究利用家蠶組織芯片表達數(shù)據(jù)以及qRT-PCR方法篩選出三個血細胞特異表達基因;并基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫分別對三個候選基因的啟動子區(qū)域進行克隆;使用重組桿狀病毒(rAcMNPV)為基因轉移載體并結合流式細胞分析技術，分析候選基因啟動子活性并對其蠶體組織特異性進行了驗證。主要研

3、究結果如下:
　　1.家蠶血細胞特異表達基因的篩選
　　基于家蠶組織芯片數(shù)據(jù)，通過qRT-PCR進行組織表達分析，最終篩選得到家蠶血細胞特異高表達的3個候選基因，分別為BmCathepsinO、Bmintegrinβ2、Bm04862。BmCathpsinO屬于半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與溶酶體的水解作用;Bmintegrinβ2是家蠶整合素β家族成員之一，參與細胞表面粘附，并在家蠶細胞中發(fā)揮免疫功能;而Bm04862是一個

4、未曾報道的新基因。
　　2.BmCathepsinO啟動子的克隆及活性分析
　　基于家蠶基因組數(shù)據(jù)，克隆了BmCathepsinO基因5端約2000bp的側翼區(qū)啟動子pBmCatO2K，利用重組桿狀病毒(rAcMNPV)作為基因轉移載體，證明克隆的啟動子序列在蠶體具有血細胞特異性活性。隨后，選擇5個不同大小的啟動子片段pBmCatO1.5K、pBmCatO1K、 pBmCatO0.5K、 pBmCatO0.2K在蠶體進行啟動

5、子活性分析，結果表明，該啟動子核心區(qū)域位于-80至+76bp，而一段254bp(-333～-80bp)的片段存在組織特異性調控元件，控制該基因在血細胞中的特異表達。
　　3.Bmintegrinβ2基因啟動子克隆以及蠶體活性分析
　　從Bmintegrinβ2基因轉錄起始位點上游分別選取了2，3和5Kb啟動子片段進行了克隆。發(fā)現(xiàn)pBmIntβ22K、 pBmIntβ23K、 pBmIntβ25K在細胞水平以及蠶體均不能驅動紅

6、色熒光蛋白表達，表明這3個啟動子無活性。隨后選取兩個跨第一內含子的啟動子pBmIntβ23KIN和pBmIntβ21.5KIN進行克隆，兩啟動子片段在病毒介導下在蠶血細胞有一定的啟動子活性，在脂肪體和絲腺中無活性。結果表明啟動子存在于第一內含子內或該區(qū)域存在增強元件，調控該基因的血細胞特異性。
　　4.Bm04862基因鑒定及其啟動子研究
　　應用RACE技術獲得Bm04862全長cDNA序列，并對其進行生物信息學分析。Bm

7、04862基因開放閱讀框819bp，共編碼273個氨基酸殘基，預測其為跨膜蛋白;對Bm04862蛋白亞細胞定位表明其聚集在細胞核膜和部分細胞質中。qRT-PCR結果表明發(fā)該基因在家蠶血細胞感染外源大腸桿菌24h后表達量顯著上調，推測該基因參與家蠶免疫防御。對其啟動子區(qū)域進行克隆得到2194bp片段，病毒介導發(fā)現(xiàn)在BmE-SWU3細胞、蠶體血細胞，脂肪體以及絲腺體均能驅動DsRed表達，細胞水平流式分析其啟動子活性為Pph啟動子的4.8倍