HCV IRES翻譯啟動(dòng)活性的細(xì)胞特異性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：HCV5’端非編碼區(qū)含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，其功能主要是調(diào)控病毒基因復(fù)制和以非帽依賴(lài)方式啟動(dòng)翻譯病毒蛋白，而且HCV5'UTR在不同基因型和株中呈現(xiàn)高度的序列保守，這也使它成為了抗病毒藥物研發(fā)的良好靶位。本實(shí)驗(yàn)旨在研究在不同宿主細(xì)胞的翻譯體系下，缺失不同結(jié)構(gòu)域的HCV5’UTR翻譯啟動(dòng)活性的差異，并探索其機(jī)制。
　　 方法：⑴以脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HCV5’UTR缺失不同結(jié)構(gòu)域并調(diào)控Fluc的真核表達(dá)質(zhì)粒與

2、調(diào)控Rluc的真核表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至不同的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后36h。提取細(xì)胞RNA進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，利用質(zhì)粒pRL-TK校正其它質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率；用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)Fluc基因相對(duì)表達(dá)活性，分析HCV5’UTR缺失不同結(jié)構(gòu)域后在不同翻譯體系中翻譯啟動(dòng)活性的差異。⑵選擇同種細(xì)胞中活性差異較大的缺失HCV5’UTR不同結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得RNA，使之與細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，以篩選出特異性的結(jié)合蛋白。

3、
　　 結(jié)果：①缺失HCV5’UTR的DomainⅠ及下游的單鏈序列后，HCV IRES的活性分別與缺失前相比：在Hela細(xì)胞和C6細(xì)胞中無(wú)明顯影響，在L-02細(xì)胞中活性下降為46％，而在293T細(xì)胞則為缺失前的146％。②缺失HCV5’UTR的DomainⅡ后，HCV IRES的活性分別與缺失前相比：在Hela細(xì)胞中，缺失后活性?xún)H為缺失前的49％，而在L-02細(xì)胞、C6細(xì)胞和293T細(xì)胞中，活性分別為缺失前的140％、160％

4、和235％。③體外轉(zhuǎn)錄出了缺失HCV5’UTR不同結(jié)構(gòu)域的RNA，并分離出了能與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論：⑴HCV5'UTR的DomainⅠ對(duì)HCV IRES在L-02細(xì)胞株中的翻譯啟動(dòng)活性具促進(jìn)作用，而在293T細(xì)胞株中有抑制作用，在C6細(xì)胞株和Hela細(xì)胞株中DomainⅠ對(duì)IRES翻譯啟動(dòng)活性無(wú)明顯作用。⑵HCV5'UTR的DomainⅡ?qū)CV IRES在Hela細(xì)胞株中的翻譯啟動(dòng)活性有促進(jìn)作用，而對(duì)其他三種細(xì)