IL-1β和IFNγ介導(dǎo)胰島INS-1E細(xì)胞凋亡的機(jī)制.pdf

1、目的:
　　研究炎性因子IL-1β、IFNγ聯(lián)合介導(dǎo)胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的機(jī)制。
　　方法:
　　1、收集臨床Ⅱ型糖尿病人和正常人的血清并記錄基本資料,用ELISA試劑盒分別檢測(cè)糖尿病組和正常組血清中IL-1β和IFNγ的含量并進(jìn)行組間比較;
　　2、將INS-1E細(xì)胞分為對(duì)照組和凋亡組,對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí),凋亡組用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子

2、培養(yǎng)基刺激48小時(shí)。MTS檢測(cè)兩組細(xì)胞的活力并進(jìn)行組間比較;光學(xué)顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)的變化;houchest33253對(duì)兩組細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色并用熒光顯微鏡觀察兩組細(xì)胞細(xì)胞核的變化;免疫熒光染色法對(duì)兩組細(xì)胞中 Bax以及線粒體進(jìn)行標(biāo)識(shí),并用熒光顯微鏡觀察Bax在細(xì)胞中與線粒體位置關(guān)系的變化;Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中蛋白質(zhì)磷酸化水平、蛋白表達(dá)量的變化并進(jìn)行組間比較;將無(wú)意義質(zhì)粒、TCTP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、shRNA阻斷質(zhì)粒分別

3、包被在腺病毒中侵染INS-1E細(xì)胞,侵染48小時(shí)后得到空載體組、TCTP過(guò)表達(dá)組、TCTP阻斷組三組細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察自帶綠色熒光的質(zhì)粒在三組細(xì)胞中的表達(dá)效率;Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞蛋白中TCTP表達(dá)量的變化;用濃度為100U/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ的炎性因子培養(yǎng)基分別作用于三組細(xì)胞,作用時(shí)間為48小時(shí),MTS檢測(cè)三組細(xì)胞的活力,用TCTP過(guò)表達(dá)組和TCTP阻斷組的細(xì)胞活力分別與空載體組的細(xì)胞活力

4、進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:
　　1、ELISA檢測(cè)糖尿病組與正常組血清的IL-1β與IFNγ的含量:結(jié)果顯示糖尿病組血清中IFNγ的濃度為0.29 ng/L,與正常組(0.08 ng/L)之間的差異有顯著性意義(P<0.01);糖尿病組IL-1β的濃度為0.38 ng/L,與正常組(0.12 ng/L)之間的差異也有顯著性意義(P<0.01)。
　　2、MTS檢測(cè)結(jié)果證實(shí)凋亡組細(xì)胞活力(0.28)與對(duì)照組(0.68)之間差

5、異有顯著性意義(P<0.01);
　　3、光鏡下凋亡組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)良好;熒光顯微鏡下houchest33258標(biāo)識(shí)的凋亡組INS-1E細(xì)胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等典型的凋亡形態(tài)改變,而對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)正常;對(duì)照組線粒體和 Bax都均散在分布于細(xì)胞質(zhì)中,而凋亡組中線粒體出現(xiàn)聚集同時(shí) Bax向線粒體遷移并與線粒體形成共定位;
　　4、Western blot檢測(cè)凋亡組的細(xì)胞蛋白并與對(duì)照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)凋亡組中TC

6、TP的表達(dá)量降低,P53和 cleaved caspase-3的表達(dá)量升高;凋亡組中 Bcl-2家族內(nèi)具有拮抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1表達(dá)量降低;Bcl-2家族內(nèi)具有促進(jìn)凋亡作用的Bax和Bad蛋白表達(dá)量變化不明顯;凋亡組中反映細(xì)胞增殖活力的激酶AKT活性降低;
　　5、熒光顯微鏡下三組細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光質(zhì)粒均大量表達(dá);過(guò)表達(dá)組 TCTP水平升高,阻斷組TCTP水平降低; MTS檢測(cè)結(jié)果顯示TCTP過(guò)表達(dá)組的細(xì)