鵝細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)的篩選.pdf

1、鵝細(xì)小病毒病(GPVS)是雛鵝的烈性傳染病，又稱小鵝瘟或Derzsy's病。多發(fā)生于4日齡至20日齡以內(nèi)的雛鵝。發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90％～100％。該病病原為鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)，能感染各種品種的雛鵝，也可以感染雛番鴨。目前，該病仍為養(yǎng)鵝業(yè)最主要的傳染病之一，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于本病長(zhǎng)期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，所以需要一種，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷方法來對(duì)該病作出早期診斷；也需要通過分析病毒的抗原成分篩選合適的

2、肽段作為亞單位疫苗用于本病的免疫防治。但這種診斷試劑和亞單位疫苗的研制，必須建立在對(duì)病毒蛋白抗原性的研究之上。細(xì)小病毒都具有基因組短小，衣殼結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，所以更容易將它們無關(guān)的抗原成分篩除，在制造亞單位疫苗和重組診斷抗原上具有很多優(yōu)勢(shì)。本研究首先構(gòu)建了含有GPVH1株非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1)基因的重組克隆載體pMD18-T-NS1和pMD18-T-VP1。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，分別作為截短表達(dá)片段PCR擴(kuò)增的模板。

3、 ⑴為了對(duì)NS1蛋白(627aa)進(jìn)行抗原表位作圖，設(shè)計(jì)了一套覆蓋整個(gè)NS1蛋白的短肽，這些短肽長(zhǎng)為50～60個(gè)氨基酸，有10～15個(gè)氨基酸重疊。為了表達(dá)這些短肽，共設(shè)計(jì)合成了15對(duì)引物。將這些亞克隆的基因片段插入至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了表達(dá)。利用切膠純化的方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化，純化蛋白經(jīng)抗GST單克隆抗體鑒定。應(yīng)用GPVH1株活疫苗毒免疫的10周齡鵝血清對(duì)表達(dá)的15個(gè)重組蛋白的抗原性進(jìn)行了檢測(cè)，We

4、sternblot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白NS(453-514)、NS(485-542)、NS(533-598)和NS(575-627)能被GPV免疫的鵝血清所識(shí)別。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)表達(dá)了覆蓋NS1蛋白C末端453-627aa的7個(gè)截短短肽，這些短肽長(zhǎng)為30個(gè)氨基酸左右，有10～15個(gè)氨基酸重疊。Westernblot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白NS(485-514)、NS(498-532)、NS(523-556)、NS(543

5、-573)、NS(564-598)和NS(599-627)能被GPV免疫的鵝血清所識(shí)別。 ⑵為了對(duì)VP1蛋白(732aa)進(jìn)行抗原表位作圖，設(shè)計(jì)并表達(dá)了19個(gè)覆蓋整個(gè)VP1蛋白的短肽，這些短肽長(zhǎng)為50～60個(gè)氨基酸，有10～15個(gè)氨基酸重疊。Westernblot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白VP(35-100)、VP(81-136)、VP(124-161)、VP(146-198)、VP(423-491)、VP(531-595)、VP

6、(616-669)和VP(678-732)能被GPV免疫的鵝血清所識(shí)別。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)表達(dá)了16個(gè)覆蓋VP1蛋白抗原性片段的短肽，這些短肽長(zhǎng)為30個(gè)氨基酸左右，有10～15個(gè)氨基酸重疊。Westernblot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白VP(35-63)，VP(50-81)，VP(111-145)，VP(136-161)，VP(423-453)，VP(462-491)，VP(531-560)，VP(548-577)，VP(61

7、6-647)，VP(634-669)，VP(678-706)和VP(697-732)能被GPV免疫的鵝血清所識(shí)別。 ⑶綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，GPVH1株NS1蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)位于NS1蛋白的羧基末端485～627aa;GPVH1株VP1蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)位于35～81aa、111～198aa、423～453aa、462～491aa、531～577aa、616～669aa和678～732aa。 ⑷對(duì)以體液免疫