青霉素過敏反應與IL-12、IL-18、IL-8R的表達及其基因多態(tài)性的研究.pdf

1、青霉素類抗生素是一類高效、低毒的抗生素,但由青霉素類抗生素引起的過敏反應在臨床藥物引起的過敏反應中,發(fā)生率居于首位,嚴重者甚至可引起過敏性休克乃至死亡病例的出現(xiàn)。血清總IgE或特異性IgE的升高是青霉素過敏反應發(fā)生的重要特征。早期對于青霉素類抗生素引起過敏反應的研究認為:其主要是由特異性IgE抗體所介導而引發(fā)的Ⅰ型超敏反應,且已研究表明,特異性IgE抗體是介導過敏反應的關鍵。隨著對其研究的深入,認為T細胞在青霉素類抗生素誘發(fā)的速發(fā)型、遲

2、發(fā)型過敏反應中均有重要作用。目前,青霉素類藥物過敏反應的預測和診斷主要是采用皮內(nèi)試驗法。該方法簡便易行,但缺點在于因病人個體差異、皮試藥劑成分不同和結果判斷標準的掌握尺度不一等諸多因素的影響,造成假陽性和假陰性率較高；尤其是對于部分高敏患者,在皮試過程即可發(fā)生休克甚至死亡。因此,開發(fā)青霉素類藥物過敏的體外診斷方法日益受到各國科研人員的重視。
　　 青霉素過敏和抗青霉素特異性抗體有密切關系,其抗青霉素類抗生素特異性抗體是由B細胞產(chǎn)

3、生,該過程受到不同的T淋巴細胞亞群分泌的多種細胞因子復雜交叉的調控。此外,青霉素過敏也不再僅限于由于IgE介導的Ⅰ型超敏反應,其過敏反應也涉及到其它幾種類型的超敏反應的發(fā)生,這些超敏反應也受到多種細胞因子的分泌的影響,從而進行著復雜而又交叉的調節(jié)和控制。
　　 現(xiàn)在隨著對免疫相關分子與青霉素過敏關系研究的深入,發(fā)現(xiàn)許多因子與過敏性疾病相關。然而,更多的候選基因以及這些候選基因的遺傳變異在青霉素過敏反映中的作用還遠未被認識。在本研

4、究中選取了IL-12和IL-18細胞因子,它們都是目前研究較為熱點的細胞因子,并且它們與臨床免疫相關疾病關系密切。
　　 本研究以青霉素過敏病人為研究對象,用RAST的方法測定了青霉素過敏病人中針對青霉素類分子主次要抗原決定簇的8種特異性IgE水平,使用ELISA方法測定青霉素過敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,PCR-SSP的方法對人群中的IL-12基因和IL-18基因的基因多態(tài)性進行了分析,同時從青霉素過敏病人與正常

5、對照間的差異基因表達的結果中挑選出IL-8R,對其在外周血白細胞中表達水平進行了檢測。從而與所測得的病人體內(nèi)的青霉素特異性抗體水平相比較,對IL-12、IL-18以及IL-8R在青霉素類抗生素過敏反應發(fā)生中的作用和地位加以討論,從而為更好的預防、診斷和治療青霉素過敏提供參考依據(jù)。
　　 目的：評價RAST方法在青霉素類抗生素過敏反應診斷中的可靠性,分析青霉素類抗生素的交叉過敏反應情況；探討側鏈結構在交叉過敏反應中的重要性。

6、>　　 方法：制備抗原決定簇紙片:制備連接青霉素G(PG)、青霉素V(PV)、阿莫西林(AX)和氨芐西林(AMP)四種藥物的主、次要抗原決定簇的抗原紙片。PG、PV、AMP、AX的主、次要抗原決定簇分別為:BPO-PLL和BPA-PLL,PVO-PLL和PVA-PLL,APO-PLL和APA—PLL,AXO-PLL和AXA—PLL。選取614例正常對照人群和606例青霉素過敏病人,引起過敏的藥物為PG、PV、AMP和AX。使用RAST

7、方法對青霉素過敏病人和正常對照組的以上8種特異性IgE水平,以正常對照組的(x)±2.33s制定標準值,病人組中高于此上線即定義為IgE陽性。根據(jù)病人皮試情況、皮試或用藥后出現(xiàn)的過敏癥狀、出現(xiàn)癥狀的時間以及病人的年齡性別等進行分組,比較不同組間IgE水平及陽性率情況。
　　 結果：本實驗制成的紙片與國外參比紙片無明顯差異(P<0.05)；同時使用主次要抗原決定簇特異性IgE抗體的檢測較單用主要抗原決定簇時的41.9％檢出率,增加

8、至63.7％；BPO-IgE、PVO-IgE、BPA—IgE和PVA-IgE水平隨青霉素過敏病人年齡升高有升高的趨勢；特異性IgE水平與性別無關；BPO-IgE和BPA-IgE的水平與出現(xiàn)過敏癥狀病人的皮試結果相關；對青霉素G和青霉素V的IgE水平與用藥后出現(xiàn)的呼吸困難癥狀有關；針對青霉素IgE陽性與皮試陰陽性及皮試后癥狀有關系；在四種青霉素類藥物中,在使用青霉素G后更易發(fā)生過敏癥狀；在使用次要抗原決定簇的病人皮試后是否出現(xiàn)過敏癥狀無密

9、切相關；青霉素過敏病人體內(nèi)IgE水平隨時間有下降趨勢。
　　 結論：本研究中所制備的青霉素類藥物抗原紙片,經(jīng)過驗證,其敏感性、特異性和穩(wěn)定性較好,能較好檢出病人血清中IgE水平；同時使用主、次要抗原決定簇特異性IgE抗體的檢測,能提高過敏病人的檢出陽性率；四種青霉素類藥物中青霉素G的IgE抗體陽性與出現(xiàn)過敏癥狀的青霉素皮試陽性更密切；青霉素過敏病人中,體內(nèi)特異性IgE水平隨時間的延長而降低。
　　 目的：測定正常人和青霉

10、素過敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,探討IL-18和IL-12在青霉素類抗生素過敏反應發(fā)生中的作用和地位。
　　 方法：依照青霉素過敏的診斷原則,即皮試陽性或皮試陰性但在應用青霉素類藥物后出現(xiàn)臨床癥狀的原則選擇青霉素過敏病人,以ELISA的方法檢測青霉素過敏病人和正常對照人群中血清IL-18和IL-12的水平。
　　 結果：青霉素過敏病人組IL-18和IL-12水平均較正常人組升高(102.8pg／ml vs6

11、7.9pg／ml,15.8ng／ml vs13.5ng／ml,P<0.05)；出現(xiàn)休克、呼吸困難、蕁麻疹等不同過敏癥狀青霉素過敏病人中血清IL-18和IL-12水平均較正常人升高,但不同癥狀間無統(tǒng)計學差異(P>0.05):皮試或用藥后出現(xiàn)癥狀的青霉素過敏病人中IL-18水平較正常人升高(P<0.05),但僅皮試陽性而無癥狀的青霉素過敏病人中IL-18水平與正常人相比無明顯變化(P>0.05)；在用藥后出現(xiàn)癥狀的青霉素過敏病人中,皮試陰性

12、者血清IL-12水平較皮試陽性者升高(P<0.05)；在速發(fā)型和遲發(fā)型過敏病人間血清IL-12和IL-18水平均無明顯統(tǒng)計學差異；出現(xiàn)不同特異性IgE抗體陽性種類數(shù)的青霉素過敏病人間IL-12和IL-18水平無明顯差異；在青霉素過敏病人組和正常人組內(nèi),血清IL-12和IL-18水平存在正相關(P<0.05)。
　　 結論：青霉素過敏病人組血清IL-18和IL-12水平均較正常人組升高,且其水平的升高和青霉素過敏的發(fā)生相關。青霉素

13、過敏病人是否會出現(xiàn)臨床癥狀與IL-18水平升高有關,皮試情況與IL-12水平相關,但在皮試或用藥后出現(xiàn)何種臨床癥狀與IL-12和IL-18水平無關。無論在青霉素過敏病人還是在正常人中,IL-12和IL-18水平存在正相關。
　　 目的：以PCR—SSP技術檢測青霉素過敏病人中IL-18基因和IL-12B基因的基因多態(tài)性(SNP),探討IL-18和IL-12B基因SNP與青霉素過敏的關系。
　　 方法：選取IL-18基因啟

14、動子區(qū)的-607A／C和-137G／C位點以及IL-12B啟動子區(qū)的-6415(CTCTAA／GC)位點和3’非翻譯區(qū)10841(C／A)位點,依照相應位點的多態(tài)性堿基類型設計相應的針對該位點的特異性PCR引物(-607A和-607C,-137G和-137C,-6415C和-6415G,10841C和10841A),使該引物3’端堿基恰好位于該多態(tài)性位點并與其相匹配,同時也設計與該特異性引物相匹配的配對引物(607R、137R,-641

15、5F、10841R)及陽性擴增用對照引物(607F、137F,-6415R、10841F)。提取青霉素過敏病人和正常對照人外周血單個核細胞基因組DNA,以其為模板,選用上述特異性引物進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增情況,看是否在特定的PCR引物中出現(xiàn)相應的PCR產(chǎn)物。同時選取一定數(shù)量的PCR進行測序分析,以驗證PCR-SSP的準確性。
　　 結果：
　　 1.使用相應位點特異性引物均能擴增出相應大小的PCR產(chǎn)

16、物,但該特異性引物不是該位點匹配堿基時則無PCR產(chǎn)物出現(xiàn)；并且經(jīng)DNA測序分析,本研究采用的PCR-SSP能準確反映待檢DNA中IL-18-607A／C和-137G／C位點以及IL-12啟動子區(qū)的-6415(CTCTAA／GC)位點和3’非翻譯區(qū)10841(C／A)位點的多態(tài)性情況。
　　 2.IL-18-607A／C和-137G／C以及IL-12-6415(CTCTAA／GC)和10841(C／A)四個位點SNP在對照組均符合

17、Hardy-Weinberg平衡分布。
　　 3.IL-18-607位點AA基因型及A等位基因在青霉素過敏病人中所占比例高于正常組(15.5％ vs9.0％,P<0.01；42.1％ vs32.5％,P<0.01)。IL-18-137位點GG基因型和G等位基因在青霉素過敏病人中所占比例低于正常組(69.3％ vs81.3％,P<0.01；84.2％ vs90.5％,P<0.01)。IL-18-607A／C位點和IL-18-137

18、G／C位點,各基因型在皮試陰陽性組間、不同青霉素過敏癥狀組間、速發(fā)或遲發(fā)的過敏類型間差異均無統(tǒng)計學意義。
　　 4.IL-12B-6415位點GC／GC的基因型和GC等位基因在青霉素過敏病人中所占比例高于正常組(37.6％ vs18.8％,.P<0.01；53.9％ vs47.7％,P<0.05)。IL-12B10841位點,在青霉素過敏病人中的CC基因型頻率高于正常對照組(35.4％ vs22.5％,P<0.05)。IL-12

19、-6415(CTCTAA／GC)位點,各基因型在皮試陰陽性間、不同青霉素過敏癥狀組間、速發(fā)或遲發(fā)的過敏類型間均無明顯統(tǒng)計學差異。IL-12B10841(C／A)位點,在蕁麻疹病人中CC基因型所占比例和C等位基因頻率均較對照組明顯升高(40.4％ vs22.5％,P<0.05,62.9％ vs50.4％,P<0.05)。
　　 5.應用SHEsis軟件平臺進行連鎖不平衡分析,IL-18-607A／C和-137G／C位點間不存在連鎖

20、不平衡(D'=0.223)；IL-12B-6415 CTCTAA／GC和10841C／A位點間也不存在連鎖不平衡(D'=0.203)。
　　 6.應用SHEsis軟件平臺對各位點進行單倍體分析,IL-18基因的AC型單倍體(-607A／-137C)在過敏病人中的頻率顯著高于正常人(P<0.01),而CG型單倍體(-607C／-137G)在正常對照組的頻率則顯著高于過敏病人組；IL-12B基因的GC／C型單倍體(-6415GC／1

21、0841C)在過敏病人中的頻率顯著高于正常人(P<0.01),而CTCTAA／A型單倍體(-6415CTCTAA／10841A)在正常對照組的頻率則顯著高于過敏病人組。
　　 7.在過敏病人組和對照組內(nèi)IL-18-607位點上AA、AC、CC基因型間的血清IL-18水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在過敏病人組IL-18-137位點GG、GC及CC基因型間比較血清IL-18水平發(fā)現(xiàn),GG組的血清IL-18水平明顯低于GC+C

22、C組(P<0.05),在對照組則無差別。
　　 8.在過敏病人組和對照組內(nèi)的IL-12B基因-6415位點或10841位點上的各基因型間的血清IL-12水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.IL-18啟動子區(qū)的-607C／A位點上A等位基因、137G／C位點上C等位基因和青霉素過敏易感性相關。IL-12B-6415CTCTAA／GC位點上GC／GC基因型和1084.1C／A位點上CC基因

23、型和青霉素過敏易感性相關。
　　 2.IL-18-607A／C位點和IL-18-137G／C位點的各基因型與青霉素病人的皮試情況、青霉素過敏癥狀及過敏類型無關。
　　 3.IL-12-6415(CTCTAA／GC)位點的各基因型與青霉素病人在皮試情況、青霉素過敏癥狀及過敏類型無明顯相關性。IL-12B10841(C／A)位點上為CC基因型時,該青霉素過敏病人傾向于出現(xiàn)蕁麻疹的癥狀。
　　 4.青霉素過敏病人中IL

24、-18-607A／C和-137G／C位點間、IL-12B-6415CTCTAA／GC和10841 C／A位點間均不存在連鎖不平衡。
　　 5.IL-18基因的-607A／-137C單倍體型和IL-12B基因的-6415GC／10841C單倍體型是發(fā)生或促進青霉素過敏的危險因素。
　　 6.IL-18基因啟動子區(qū)域的-607位點基因多態(tài)性對IL-18血清水平無明顯影響；-137位點的多態(tài)性對IL-18水平有一定的調控作用,

25、其GG基因型可降低IL-18表達水平。IL-12B基因啟動子區(qū)域的-6415位點和10841位點基因多態(tài)性與IL-12在血清水平無關。
　　 目的:通過基因芯片技術探索在青霉素過敏病人與正常人間差異基因的表達,從中挑選與細胞因子相關分子,進一步探索該分子在青霉素過敏中的表達情況及作用。
　　 方法:采集青霉素過敏病人及對照人群的外周血并分離其單個核細胞。以表達譜基因芯片技術檢測青霉素過敏病人和正常人間的外周血單個核細胞的

26、差異基因表達情況。選取與細胞因子相關的分子IL-8R,以熒光定量RT-PCR及Western Blot檢測青霉素過敏病人及對照人群的外周血中IL-8RA和IL-8RB的表達情況。
　　 結果:
　　 1.表達譜基因芯片發(fā)現(xiàn)青霉素病人組和正常對照間共有3294條(1731條高表達,1563條低表達)差異表達基因；其中差異明顯的有1994條,和免疫相關的基因有338條；其中IL-8R這一與細胞因子相關分子在青霉素病人組較對照

27、組明顯升高(平均信號強度比值為3.49)。
　　 2.熒光定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在皮試陰性的青霉素過敏病人IL-8RA mRNA和蛋白表達量較正常組升高(P<0.05),其中呼吸困難組和蕁麻疹組的升高更為明顯(P<0.01)；IL-8RB mRNA表達量在皮試陰性的各癥狀組也均無明顯統(tǒng)計差異(P>0.05)。
　　 3.在青霉素過敏病人的遲發(fā)型組中的IL-8RA mRNA和蛋白表達水平均明顯高

28、于對照組(P<0.05)；無論在遲發(fā)型或速發(fā)型組IL-8RB mRNA和蛋白表達水平與對照組相比均無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.以表達譜基因芯片技術發(fā)現(xiàn)了青霉素病人和正常對照間大量的差異表達基因,為后續(xù)探討青霉素過敏機制提供了候選基因的篩選。
　　 2.青霉素過敏病人外周血單個核細胞存在IL-8RA的高表達,其表達水平的升高是青霉素過敏病人出現(xiàn)蕁麻疹和呼吸困難的促進因素,且傾向于出現(xiàn)