甲氨蝶呤、辛伐他汀對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血單個(gè)核細(xì)胞Th17-IL-17的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:不同濃度甲氨蝶呤對(duì)類(lèi)風(fēng)關(guān)及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞Th17/IL-17產(chǎn)生的影響背景:類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(類(lèi)風(fēng)關(guān))是一系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫病,反復(fù)發(fā)作的滑膜炎可造成關(guān)節(jié)破壞,功能漸進(jìn)性障礙,嚴(yán)重者致殘。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是目前臨床中廣泛應(yīng)用和首選的改變病情抗風(fēng)濕藥物(disease-modifyinganti-rheumaticdrugs,DMARDs),其作用機(jī)制仍不清楚。Th17細(xì)胞作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)

2、胞,其分泌的IL-17是參與類(lèi)風(fēng)關(guān)炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子。MTX作為有效的類(lèi)風(fēng)關(guān)治療藥物,它的抗炎作用與Th17/IL-17關(guān)系尚不明確。目的:體外觀察不同濃度的MTX對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)Th17細(xì)胞分化和IL-17合成的影響,探究MTX有效治療類(lèi)風(fēng)關(guān)的可能機(jī)制。方法:分離類(lèi)風(fēng)關(guān)患者和健康人PBMCs,予不同濃度MTX預(yù)處理,抗人CD3和抗人CD28單抗刺激后,

3、37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的不同階段收集細(xì)胞或上清液,采用逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR技術(shù)分析IL-17mRNA的表達(dá)水平;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-17的濃度;熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞表面抗原CD4和胞內(nèi)蛋白IL-17,流式細(xì)胞儀分析CD4+IL-17+細(xì)胞的比例。結(jié)果:類(lèi)風(fēng)關(guān)和健康人PBMCs經(jīng)抗人CD3和抗人CD28單抗激活后,IL-17mRNA表達(dá)水平(RA:0.78±0.14vs.0.54±0.15,p=0.02:HC:0.

4、71±0.17vs.0.34±0.14,p＜0.01)和IL-17蛋白分泌水平(RA:436.16±205.08vs.15.36±6.57,p〈0.01:HC:271.83±145.11vs.11.48±7.12,p＜0.01)明顯升高,而不同濃度MTX組不同程度地減弱了IL-17mRNA和IL-17分泌蛋白水平,5.0和25.0μg/mlMTX顯著抑制IL-17mRNA和IL-17蛋白產(chǎn)生(p〈0.05)。與健康人PBMCs相比較,類(lèi)

5、風(fēng)關(guān)PBMCs產(chǎn)生更高水平的IL-17,同時(shí)MTX更明顯地抑制類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMCs表達(dá)和分泌IL-17。MTX劑量對(duì)數(shù)值(lgMTX)與IL-17mRNA表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)關(guān)系(RA:R2=0.96,p=0.02;HC:R2=0.94,p=0.03),這種效應(yīng)關(guān)系未表現(xiàn)在IL-17蛋白分泌水平。MTX沒(méi)有明顯降低PBMCs中CD4+IL-17+T細(xì)胞的比例。結(jié)論:MTX抑制類(lèi)風(fēng)關(guān)及健康人PBMCs合成與分泌工L-17,這種作用在類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMC

6、s更明顯,抑制IL-17產(chǎn)生可能是MTX有效治療類(lèi)風(fēng)關(guān)的機(jī)制之一。第二部分:辛伐他汀對(duì)類(lèi)風(fēng)關(guān)及健康人單個(gè)核細(xì)胞合成工L-17及Thl7轉(zhuǎn)錄因子BATF的影響背景:類(lèi)風(fēng)關(guān)作為一種慢性炎癥性疾病,在破壞關(guān)節(jié)滑膜導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失的同時(shí)也增加了心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)。他汀類(lèi)降脂藥物是心血管重要治療藥物之一,近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用并在類(lèi)風(fēng)關(guān)治療中有明顯的抗炎作用。IL-17是參與類(lèi)風(fēng)關(guān)炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子,B細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子(B-cellac

7、tivatingtranscriptionfactor,BATF)是調(diào)控IL-17基因轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄因子,其屬于激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)家族。他汀類(lèi)藥物可通過(guò)AP-1途徑影響相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生,是否會(huì)通過(guò)作用于BATF而抑制IL-17合成而發(fā)揮在類(lèi)風(fēng)關(guān)中的治療作用尚不明確。目的:研究辛伐他汀對(duì)類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMCs合成IL-17的作用及對(duì)B細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子BATF的影響。方法:健康人和類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMCs在有

8、或無(wú)辛伐他汀或甲羥戊酸條件下,予PMA和離子霉素刺激培養(yǎng)。RT-PCR技術(shù)分析IL-17、BATF和NFAT2的mRNA表達(dá)水平,以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參;ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-17濃度;WesternBlot分析BATF蛋白在辛伐他汀作用后表達(dá)變化。結(jié)果:類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMCs在20μM辛伐他汀作用后,PMA和離子霉素所誘導(dǎo)的IL-17mRNA水平被抑制(0.60±0.18vs.0.3l±0.17,p=0.

9、04),IL-17蛋白分泌水平也減弱(79.64±12.67vs.44.61±3.90,p9-0.01)。類(lèi)風(fēng)關(guān)PBMCs由BATFmRNA水平明顯高于健康人(0.39±0.05vs.0.25±0.07,p=0.04),但辛伐他汀作用后BATFmRNA表達(dá)水平變化不明顯,BATF蛋白水平也無(wú)明顯變化。甲羥戊酸與辛伐他汀共加入PBMCs后,辛伐他汀抑制IL-17產(chǎn)生的作用明顯降低。結(jié)論:辛伐他汀能夠抑制活化的PBMCs合成和分泌IL-17