原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)制的初步探討.pdf

1、本文對(duì)原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究分為兩個(gè)部分;
　　 第一部分：POAG患者血清、淚液中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子定量性分析。
　　 目的：既往研究表明神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病患者血清BDNF含量較正常對(duì)照組明顯減少，并提示BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著尤為重要作用；目前多數(shù)專家明確地認(rèn)同青光眼屬于一種眼科神經(jīng)退行性疾病，關(guān)于BDNF對(duì)青光眼RGCs的保護(hù)作用研究頗多，提示BDNF在POAG神經(jīng)損害機(jī)制

2、中起著關(guān)鍵作用。甚至國(guó)外有報(bào)道測(cè)定血清中BDNF含量與POAG患者存在相關(guān)性，但在國(guó)內(nèi)缺乏有關(guān)POAG家系患者血清及淚液BDNF含量的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將采用人類單克隆抗BDNF抗體ELISA試劑盒檢測(cè)POAG患者血清及淚液BDNF的含量。為探討POAG發(fā)病機(jī)制、尋找POAG早期診斷的檢測(cè)方法及評(píng)價(jià)POAG病情進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循赫爾辛基宣言及遺傳學(xué)研究原則，采集山東陽(yáng)谷一顯

3、性遺傳POAG家系和14例散發(fā)POAG患者的臨床資料、血液和淚液標(biāo)本。本次試驗(yàn)我們選取該家系中6名POAG患者(Ⅲ-8、Ⅲ-10、Ⅲ-12、Ⅲ-18、Ⅲ-20及Ⅲ-31)，并于2010年4月至2011年8月連續(xù)收集聊城市人民醫(yī)院眼科門診及住院部就診的散發(fā)POAG患者14例。20例POAG患者平均年齡為45.35歲，其中男12例，女8例。20-30歲年齡組7例，35-45歲年齡組9例，50-75歲年齡組4例。同時(shí)收集與實(shí)驗(yàn)組年齡、性別分別

4、相對(duì)應(yīng)的健康志愿者50例，其中25例為血清對(duì)照組，男13例、女12例，平均年齡為44.9歲；25例為淚液對(duì)照組，男13例，女12例，平均年齡為44.9歲。血清及淚液的采集分別于上午9:00-11:00進(jìn)行。抽取參與人員上肢靜脈血5ml(避免溶血)，室溫30分鐘凝固后，3000r/m離心10min制備血清標(biāo)本；16倍的裂隙燈下，用規(guī)格為20μl的采血毛細(xì)玻璃微管收集參與人員雙眼無(wú)刺激基礎(chǔ)淚液10μl；所有標(biāo)本均置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｗ?/p>

5、后采用人類單克隆抗BDNF抗體ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))試劑盒測(cè)定各標(biāo)本BDNF含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析。
　　 結(jié)果：陽(yáng)谷顯性遺傳家系POAG患者與散發(fā)POAG患者血清、淚液BDNF的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((2.78±2.1)ng/mlVS(3.10±1.72)ng/ml，P=0.727>0.05；(0.63±0.13)ng/mlVS

6、(0.73±0.22)ng/ml，P=0.299>0.05)；POAG患者組血清BDNF與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性((3.01±1.79)ng/ml VS(3.59±3.46)ng/ml；P=0.510>0.05)；POAG患者組淚液BDNF含量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((0.70±0.2)ng/ml VS(0.89±0.32)ng/ml；P=0.032<0.05)。
　　 結(jié)論：BDNF在POAG顯性遺傳家系

7、的發(fā)病中起到的作用有限；POAG患者血清中BDNF與正常對(duì)照組相比存在的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血清BDNF易受多種因素影響，與POAG發(fā)病關(guān)聯(lián)不明顯，檢測(cè)血清BDNF含量難以為POAG早期診斷提供有效的信息；POAG患者淚液BDNF含量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示淚液中BDNF的含量減少與POAG的發(fā)病密切有關(guān)，檢測(cè)淚液BDNF含量有可能有利于POAG的早期診斷。
　　 第二部分：原發(fā)性開角型青光眼患者血清miR

8、-29b的差異性表達(dá)。
　　 目的：既往研究發(fā)現(xiàn)小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)與POAG的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，小梁網(wǎng)ECM中大量不溶性蛋白堆積在小梁網(wǎng)孔周圍，阻塞了房水的外流通道引起高眼壓。最近研究顯示miR-29b可負(fù)向調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)ECM的合成、降解多種基因的表達(dá)，體外培養(yǎng)的小梁網(wǎng)在慢性應(yīng)激反應(yīng)下miR-29b呈現(xiàn)低表達(dá)，提示當(dāng)miR-29b的抑制作用減弱時(shí)，小梁網(wǎng)ECM成分增加，引起房水外引流阻

9、力增加，導(dǎo)致眼內(nèi)高壓形成青光眼。但國(guó)內(nèi)外尚缺乏血清miRNA是否與POAG相關(guān)的內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)并比較散發(fā)POAG及健康對(duì)照組靜脈血清miR-29b的表達(dá)差異性，分析miR-29b是否與POAG的發(fā)病存在相關(guān)性，旨在探討miRNA在散發(fā)POAG患者分子水平的致病機(jī)制，為開辟青光眼防治新途徑提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：選用5名散發(fā)性POAG患者平均年齡為48.6歲，其中男3例，女2例；同時(shí)選取與實(shí)驗(yàn)組性別及年

10、齡相匹配的5名健康志愿者作為對(duì)照，平均年齡為50.2歲，其中男3例，女2例。采取參與人員的上肢靜脈血5ml(避免溶血)，室溫30分鐘凝固后，3000r/m離心10min，提取上清液置于干燥無(wú)RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)并比較miR-29b在散發(fā)POAG患者及健康對(duì)照人血清中的表達(dá)情況，管家基因U6作為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，將不同標(biāo)本的F值(F=2-△△Ct)進(jìn)行比較?！鰿t=目

11、的基因(miR-29b)Ct值-內(nèi)參照基因(管家基因U6)Ct值，△△Ct=散發(fā)POAG患者組△Ct-正常對(duì)照△Ct。采用SPSS13.0軟件對(duì)各樣本△Ct進(jìn)行t檢驗(yàn)；以P<0.05具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：5例散發(fā)POAG患者miR-29b相對(duì)表達(dá)量分別是正常對(duì)照組的0.12，0.23，0.06，0.09和1.62倍，其中4例患者miR-29b表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)。5例散發(fā)POAG患者miR-29b基因的平均表達(dá)量是正常對(duì)照組的

12、0.152倍，P=0.028，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：散發(fā)POAG患者miR-29b基因的表達(dá)量是正常對(duì)照組的0.152倍，miR-29b在散發(fā)POAG血清中表達(dá)明顯下調(diào)，提示除既往發(fā)現(xiàn)的致病基因突變以外，miR-29b下調(diào)在POAG發(fā)病中可能發(fā)揮著重要作用。調(diào)控基因miR-29b下調(diào)可以通過(guò)其減弱對(duì)小梁網(wǎng)ECM合成的負(fù)調(diào)節(jié)，使小梁網(wǎng)ECM合成增加，從而參與散發(fā)POAG的高眼壓發(fā)病機(jī)制。該結(jié)果為POAG發(fā)病機(jī)制研究提