甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白對人肝星狀細胞的活化作用.pdf

1、背景：
　　 甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(Parathyroid hormone-related protein，PTHrP)最初是從與高鈣血癥相關(guān)的惡性腫瘤組織中分離出的一種多肽類物質(zhì)，PTHrP的活性位置位于1-34的氨基酸肽段，而成熟有活性的分泌形式為PTHrP(1-36)，PTHrP起作用的形式有內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌三種，主要為旁分泌形式，PTHrP自發(fā)現(xiàn)以來目前確定的內(nèi)分泌功能有三個，分別為:腫瘤來源導致骨吸收繼發(fā)高鈣血癥

2、，促進正常乳腺泌乳，在胚胎時期維持胎盤鈣代謝平衡。PTHrP與甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)有著相似的結(jié)構(gòu)，PTHrP與其受體PTHR廣泛存在于體內(nèi)多種正常組織器官，參與血管生成、骨形成、乳腺發(fā)育等多種生理過程，但在不同種屬、不同組織中PTHrP可能與不同受體結(jié)合，產(chǎn)生不同的效應(yīng)。
　　 多年來PTHrP的研究大多關(guān)于骨骼和腫瘤方面，并已有多年的實驗和臨床研究證實其具有促進骨質(zhì)形成的作用，臨床上有

3、應(yīng)用PTHrP促進骨質(zhì)合成治療骨質(zhì)疏松癥，取得了良好的治療效果，為一種起效快、副作用少的骨形成促進劑。但另一方面有個別研究顯示PTHrP可促進腎小管上皮細胞的分化，從而促進腎纖維化的發(fā)生，且此作用與TGF-β1(transforming growth factor-β1)，EGF(endothelial growth factor)以及VEGF(vascular endothelial growth factor)等細胞因子密切相關(guān)。T

4、GF-β1是很強的促纖維因子，在各種纖維化過程中處于中心地位，包括肝纖維化，但關(guān)于PTHrP在肝臟中的作用尚未有系統(tǒng)的研究。
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種慢性肝病進展中由于肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，導致過多的膠原在肝內(nèi)沉積，常伴發(fā)于慢性炎癥并可進一步發(fā)展為肝硬化、肝癌。促進肝纖維化形成的細胞有:肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSCs)、Kuffer細胞、肝門成纖維細胞等間質(zhì)細

5、胞，而肝星狀細胞是主要的膠原纖維來源。在肝臟損害過程中，一般認為是凋亡的肝細胞會釋放ROS(reactive oxygenspecies)和一些炎癥趨化因子，使淋巴細胞和巨噬細胞聚集，上述的炎癥細胞會分泌可溶性的細胞因子如TGF-β1、TNF-α(tumor necrosis factor-α)、FGF(fibroblast growth factor)等，這些細胞因子可將HSCs激活為肌成纖維樣細胞（myfibroblasts）。HS

6、Cs的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，現(xiàn)有的關(guān)于HSCs的兩個活化假說，其共同點是激活后該細胞本身可分泌更多的上述促進纖維化的細胞因子，并產(chǎn)生膠原、蛋白聚糖等，使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量堆積，導致肝纖維化的發(fā)生。而在HSCs的多種活化刺激物中TGF-β1處于中心地位，是最強的促纖維生成因子，其可活化HSCs并誘導膠原合成，而活化的HSCs自身也會分泌TGF-β1，形成一個正反饋環(huán)路。當HSCs活化

7、后，其強烈表達α-SMA(alpha-smooth muscle actin)，此因子為成纖維細胞標記物，為HSCs活化的標志;另活化的HSCs還大量合成作為ECM主要組成成分的膠原蛋白(collagen)和膠原降解酶如金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等，這些因子主要來源于HSCs。此過程的持續(xù)使得膠原沉積和肝功能損傷最終導致肝纖維化。
　　 PTHrP在正常肝臟中有表達，而早在1993年就

8、有報道內(nèi)毒素血癥時肝細胞內(nèi)PTHrP表達明顯增高并且PTHrP可引起肝內(nèi)細胞的急性炎癥損傷，上述結(jié)果表明PTHrP在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中可起細胞因子的作用。內(nèi)毒素血癥對于肝臟的作用早在1975年就已有報道，現(xiàn)今內(nèi)毒素在急慢性肝損傷中起重要作用的觀點已被廣泛接受，且其存在還與肝病的嚴重程度相關(guān)，但內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下PTHrP起何種作用尚未見報道，值得我們關(guān)注。隨后有研究對肝硬化患者血中PTHrP(1-84)濃度的測定發(fā)現(xiàn)與正常人相比沒有明顯的

9、增高，并且與病變的嚴重程度亦沒有相關(guān)性。但已有的體內(nèi)研究和我們前期研究均證實PTHrP在正常機體血循環(huán)中表達量非常低，甚至低于檢測標準的下限。現(xiàn)已知PTHrP起作用可通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌三種模式，而最主要的是旁分泌途徑，因此盡管肝硬化患者血中PTHrP無明顯增高，亦不能排除其通過旁分泌或自分泌的途徑影響肝臟內(nèi)的其他細胞，因此PTHrP在肝內(nèi)分泌及作用非常值得進一步的研究。
　　 現(xiàn)有的治療骨質(zhì)疏松的藥物主要包括拮抗骨吸收劑

10、和刺激骨形成劑兩大類，但對慢性肝病導致的骨質(zhì)疏松療效欠佳，PTHrP的出現(xiàn)為我們提供了一個新的選擇，但PTHrP作為一種前景良好的骨形成促進劑，卻具有促腎纖維化的作用，而且對肝臟的影響作用尚不明確;且慢性肝病內(nèi)毒素血癥時肝細胞中PTHrP明顯升高并可造成肝細胞的急性損傷，但具體機制尚不明確，而國內(nèi)外均未見PTHrP對肝內(nèi)各細胞影響的系統(tǒng)性研究。PTHrP作為治療骨質(zhì)疏松的藥物用于人體，其對正常人或患有慢性肝病的患者影響如何亦未見報道，因

11、此PTHrP對于肝臟的影響非常值得進一步的探討。
　　 研究目的和意義肝星狀細胞的活化一直是肝纖維化研究中的熱點，因此PTHrP對肝星狀細胞的影響作用給我們提供了一個新的研究切入點，可為PTHrP作為治療手段提供藥理學依據(jù)，亦可揭示PTHrP引起肝內(nèi)細胞的急慢性損傷的病理機制。
　　 材料和方法：
　　 1、商業(yè)購買人肝星狀細胞兩株，分別為人肝星狀細胞的正常細胞株HSC和其活化株LX-2，分別予以不同濃度的PTH

12、rP(1-36)(0.1nM、1nM、10nM、100nM)處理不同時間段(6h、12 h、24 h、48 h)，后收集細胞總蛋白、總RNA及其細胞培養(yǎng)上清液;
　　 2、運用相對定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(RT-qPCR)及蛋白質(zhì)印跡方法(Western-blot)分別從基因水平及蛋白水平檢測上述處理后細胞產(chǎn)物的活化相關(guān)因子(α-SMA、MMP-2、collagenⅠ、TGF-β1);
　　 3、運用細胞免疫熒光方

13、法(Immunofluorescence)檢測PTHrP(1-36)(100 nM，48 h)處理后HSC和LX-2中α-SMA表達情況;
　　 4、運用酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法(ELISA)檢測PTHrP(1-36)(10-100nM，24-48 h)處理后HSC培養(yǎng)上清液中TGF-β1濃度變化（單位Pg/ml）;
　　 5、統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組間差異比較采用多樣本均數(shù)比較

14、方差分析（ONEWAY-ANOVA），結(jié)果以均數(shù)±標準差的方式表示，其中RT-qPCR結(jié)果對照組統(tǒng)一量化為1，Western-blot結(jié)果對照組統(tǒng)一量化為100，所有統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們從基因和蛋白兩個水平檢測了PTHrP(1-36)處理的兩種細胞中α-SMA、collagenⅠ（Ⅰ型膠原）、MMP-2（金屬蛋白酶-2）三個與肝星狀細胞活化密切相關(guān)的因子，發(fā)現(xiàn)兩種細胞在濃

15、度10-100nM處理24-48 h的條件下α-SMA呈現(xiàn)2-3倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05);10-100nM處理24-48 h的條件下兩種細胞的MMP-2基因和蛋白水平呈現(xiàn)2-3倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05);HSC在10-100nM處理24-48 h的條件下Ⅰ型膠原的基因和蛋白水平呈現(xiàn)約2倍的上調(diào)趨勢(P＜0.05)，而LX-2僅在100nM處理24-48 h的條件下出現(xiàn)Ⅰ型膠原基因和蛋白水平的上調(diào)(P＜0.05)。
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16、、運用細胞免疫熒光方法檢測PTHrP(1-36)處理后兩種細胞，發(fā)現(xiàn)正常HSC對照組熒光基本缺如，而處理組與對照組相比出現(xiàn)活化標志蛋白α-SMA的表達明顯增高，在LX-2細胞亦觀察到處理組比對照組稍升高。
　　 3、HSC經(jīng)PTHrP(1-36)處理后，出現(xiàn)TGF-β1的合成和分泌增高，在10-100nM處理24小時后可檢測到差異，其中在100 nM PTHrP處理48 h后，TGF-β1的基因和蛋白的相對表達量分別為2.963

17、±0.337和356.608±6.587，它們的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但LX-2需在濃度100nM處理48 h后才具有明顯差異。而HSC細胞培養(yǎng)上清液中的總TGF-β1為513.6425±82.9245 pg/ml，其對照組則為190.0733±11.642 pg/ml，兩者比較存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　 主要結(jié)論：
　　 1、對于正常的人肝星狀細胞HSC，PTHrP(1-36)處理后可快速引起

18、該細胞的活化標志蛋白α-SMA的強烈表達，以及collagenⅠ、MMP-2的表達增加，并誘導強促纖因子TGF-β1的合成和分泌，而上述效應(yīng)在PTHrP(1-36)濃度為10nM作用時間為24 h后即可檢測到，上述結(jié)果表明PTHrP(1-36)對正常人肝星狀細胞具有活化作用。
　　 2、對于已活化的人肝星狀細胞株LX-2，PTHrP(1-36)亦可引起α-SMA、collagenⅠ、MMP-2和TGF-β1的表達增加，其中α-S

19、MA、MMP-2和TGF-β1的增多在PTHrP(1-36)濃度為10nM作用時間為24 h后可檢測到，而collagenⅠ則在PTHrP(1-36)濃度為100 nM作用時間為24 h后方可檢測到，上述結(jié)果表明PTHrP(1-36)可使已活化的星狀細胞合成更多的促纖因子，但膠原的增加可能需要更高的濃度和更長時間。
　　 3、PTHrP(1-36)可引起正常人肝星狀細胞的活化，以及促使已活化的星狀細胞合成更多的促纖因子，在兩種細