菜青蟲酚氧化酶抑制劑的抑制動力學及其構效關系（QSAR）研究.pdf

1、酚氧化酶 (Phenoloxidase，PO) (EC.1.14.18.1)又稱酪氨酸酶 (Tyrosinase)，是結構復雜的多亞基的含銅氧化還原酶。它廣泛存在于動物、植物和微生物等生物體內，與人體的衰老、傷口愈合、果蔬的褐變等有密切關系。它是昆蟲體內的一種重要酶類，在昆蟲的變態(tài)發(fā)育和免疫系統中起著重要作用。由于酚氧化酶具有重要的理論意義和發(fā)展前景，大量的研究工作集中在此領域，篩選、設計、合成酚氧化酶抑制劑成為研究熱點。 在前

2、期研究的基礎上，本文以菜青蟲 (Pieris rapae L.) 酚氧化酶為試驗對象，測定了5，7，4’-三羥基黃酮等化合物對菜青蟲幼蟲生長發(fā)育的影響；選取銅鐵試劑等化合物為酶抑制劑，研究它們對酚氧化酶的抑制作用；采用我們課題組自主設計、合成的 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲等化合物為效應物，研究了它們對菜青蟲酚氧化酶的抑制動力學，并建立了抑制作用模型；根據測得的抑制活性結果，進行了定量的結構與活性關系的研究，獲得了具有較強預測能

3、力的構效關系模型；應用FlexX法將抑制劑小分子與酚氧化酶活性位點成功進行了分子對接。本文的主要研究內容和結果如下。 1．選用5，7，4’-三羥基黃酮、槲皮素、蘆丁、5-甲氧基水楊酸和曲酸五種化合物，采用觸殺和攝食毒力法進行了生物活性測定，研究生物源化合物對菜青蟲幼蟲生長發(fā)育的影響，結果表明，5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對菜青蟲幼蟲生長發(fā)育具有明顯的影響，浸漬法處理后72 h，兩種化合物對試蟲致死LC<,50>值分別為0.2

4、26和0.951 g/L；葉片藥膜法處理后72 h，LC<,50>值分別為0.062和2.420g/L。采用葉片藥膜法時，當5，7，4’-三羥基黃酮的濃度高于 0.200 g/L時，所有試蟲均不能正常化蛹；采用浸漬法時，與對照相比，用5，7，4’-三羥基黃酮、槲皮素、蘆丁、5-甲氧基水楊酸和曲酸處理的試蟲5齡幼蟲體重增長量明顯降低。 2．對菜青蟲酚氧化酶進行初步分離純化，并研究了基本酶學特性。研究結果表明：酶活力存在于35％飽和

5、度硫酸銨的沉淀中，得率為 69.52％，再經Sephadex G-100凝膠過濾層析進一步純化，測得比活力為粗酶的6.22倍，得率為42.50％。研究部分純化的菜青蟲酚氧化酶的基本特性得出，該酶的最適pH值為7.0，pH在6.5～7.4范圍內酶保持穩(wěn)定的活力。最適溫度為42℃，當溫度低于32℃時，酶具有穩(wěn)定的活力。研究金屬離子對酶活力的影響，結果表明Na<'+>和K<'+>對酶活力沒有影響：Cu<'2+>在0～0.100 mmol/L

6、范圍內對酶活力表現激活作用，濃度大于0.125 mmol/L 時表現抑制作用，其IC<,50>為0.651 mmol/L。 3．測定了4-己基間苯二酚、4-十二烷基間苯二酚、銅鐵試劑、5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對酶活力的抑制作用，并探討了其抑制機理。研究結果表明：4-己基間苯二酚和4-十二烷基間苯二酚對酶表現可逆抑制效應，均為競爭型抑制類型，其IC<,50>分別為1.50 μmol/L 和1.12μmol/L，抑制常數K

7、<,>分別為0.50 μmol/L，和0.47 μmol/L；銅鐵試劑對酶表現為可逆抑制效應，為競爭型抑制類型，其IC<,50>為0.10 mmol/L，K<,I>為0.076 mmol/L；5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對菜青蟲酚氧化酶具有明顯的抑制作用， IC<,50>分別為25.65 mg/L 和43.94 mg/L；研究不同濃度銅離子對該酶的影響，結果表明Cu<'2+>在0～0.100 mmol/L 范圍內對酶活力表現激活作用

8、，濃度大于0.125 mmol/L 時表現抑制作用，其IC<,50>為0.651 mmol/L。 4．以L-酪氨酸和L-DOPA為底物，在氧飽和的條件下測定酚氧化酶氧化底物的動力學過程：測定抑制劑3-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲 (3-H-4-MBT)和2-羥基苯甲醛(2-HBD)對酚氧化酶單酚酶和二酚酶活性的影響，研究結果表明：3-H-4-MBT和2-HBD均能顯著抑制單酚酶和二酚酶活性，在酶的測活體系中加入3-H-4-M

9、BT或2-HBD，二者均能顯著延長反應體系到達穩(wěn)態(tài)的時間，即這兩種化合物均可延長酶反應的遲滯時間。研究結果顯示3-H-4-MBT和2-HBD均為可逆的非競爭性抑制劑，3-H-4-MBT 對單酚酶和二酚酶的IC<,50>分別為0.14±0.02 μmol/L 和0.26±0.04 μmol/L，對二酚酶的抑制常數K<,I>(K<,I>=K<,IS>)為0.30μmol/L；2-HBD對單酚酶和二酚酶的IC<,50>分別為8.08±0.11

10、 mmol/L 和4.14±0.08mmol/L，對二酚酶的抑制常數 K<,I>(K<,I>=K<,IS>)為 1.21 mmol/L。在不同濃度的3-H-4-MBT(或2-HBD)測活體系中，測定酚氧化酶氧化底物L-DOPA的動力學過程，隨著反應時間的增加，反應體系逐漸到達穩(wěn)態(tài)，此時反應歷程為一直線。根據鄒氏動力學原理，建立了3-H-4-MBT (2-HBD)對酚氧化酶的抑制模型，并求得抑制反應速率常數k<,-0> 和k<,+0>。

11、 5．定量構效關系(QSAR)是農藥分子設計中很重要的方法，本文詳細介紹了2D-QSAR中的Hansch-Fujita法及3D-QSAR中的比較分子力場分析(CoMFA)法和比較分子相似指數分析(CoMSIA)法，并運用上述三種方法對酚氧化酶抑制劑進行了構效關系研究。 運用 Hansch-Fujita 法對苯甲醛類、苯甲酸類和苯甲醛縮氨基硫脲類三組化合物進行了2D-QSAR研究，其中采用了Hammett電子效應參數σ、疏水

12、性參數clogP、立體效應參數MR和氫鍵受體共四個參數，研究結果表明，苯甲酸類和苯甲醛縮氨基硫脲類兩組化合物的構效關系特點比較相似，這也說明此兩類化合物很可能作用在酶的同一位點，并且氫鍵受體和立體效應參數是影響化合物抑制活性的兩大因子；而苯甲醛類化合物的構效關系不同于上述兩組化合物，影響該組化合物生物活性的因子主要是疏水性參數clogP。 應用CoMFA和CoMSIA兩種方法，采用公共亞結構基礎的疊合原則，進行了三維定量構效關系

13、(3D-QSAR)研究，研究結果表明，構建的CoMFA和CoMSIA模型具有很好的預測能力，統計結果可靠。CoMFA模型中使用了6個主成分，模型的交叉驗證系數q<'2>=0.926，預測標準誤(SEE)為0.250，非交叉驗證系數r<'2>=0.986。CoMSIA模型的建立采用了立體場(steric)、靜電場(electrostatic)、疏水場(hydrophobic)、氫鍵受體場(hydrogen bond acceptor)和氫

14、鍵供體場(hydrogen bond donor)五種場的自由組合。當模型采用立體場、疏水場和氫鍵受體場三個場時，模型的交叉驗證系數q<'2>=0.933，非交叉驗證系數r<'2>=0.984，F值和SEE值分別為381.764和0.271。因此，獲得的3D-QSAR模型將為設計新穎、高活性的酚氧化酶抑制劑提供理論指導。 6．本文采用FlexX法，以抑制劑小分子為配體，以抗生鏈酶菌(S.Castaneoglobisporus)酚

15、氧化酶晶體(PDB：1WX2)為受體進行了分子對接。研究結果表明：用FlexX法將抑制劑小分子成功對接到酶的活性中心，抑制劑在酶活性位點的結合方式有三種，第一種結合方式是苯甲醛縮氨基硫脲類化合物與酶活性位點的結合，其主要結合模式為化合物上縮氨基硫脲結構中的“夾鉗”(H<'21>-N<'9>-C<'10>-N<'12>-H<'22>)結構與酪氨酸殘基(Tyr<'98>)上的氧原子形成氫鍵；第二種結合方式是苯甲醛類化合物與酚氧化酶活性位點的