木瓜蛋白酶膜結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、X-射線晶體衍射分析在分子生物學(xué)中起著非常重要的作用，因此需要有適合做衍射分析的蛋白質(zhì)晶體。然而，生物大分子的許多特性不同于有機(jī)和無機(jī)的小分子，例如：靜電學(xué)性質(zhì)、較復(fù)雜的形狀及物理化學(xué)不穩(wěn)定性等等，這就使生物大分子的結(jié)晶過程變得較為復(fù)雜。因此，獲得質(zhì)量完美的蛋白質(zhì)晶體成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要瓶頸，需要探索新的結(jié)晶方法以制備蛋白質(zhì)等生物大分子晶體。用膜結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶蛋白質(zhì)可得到適合于衍射分析的大分子蛋白質(zhì)晶體。 首先本文采用聚丙烯中

2、空纖維微孔膜對木瓜蛋白酶的靜態(tài)膜結(jié)晶過程進(jìn)行了沉淀劑的選擇和優(yōu)化，評價(jià)了不同溫度和膜面積下的溶劑跨膜通量。結(jié)果表明：對于木瓜蛋白酶的滲透膜結(jié)晶，在以pH值4．7的醋酸鹽緩沖溶液和25%的氯化鎂溶液作為沈脫液條件下，磷酸銨（NH4）3PO4可作為結(jié)晶過程的優(yōu)良沉淀劑，在適當(dāng)?shù)臐舛龋?%）和溫度（15℃）范圍，能夠制備出較完美的木瓜蛋白酶晶體。 然后使用聚偏氟乙烯（PVDF）中空纖維膜對木瓜蛋白酶進(jìn)行動態(tài)滲透膜結(jié)晶實(shí)驗(yàn)研究?？疾炝瞬?/p>

3、同蛋白質(zhì)溶液濃度、沈脫液濃度、溫度、膜面積以及料液流速對木瓜蛋白酶動態(tài)滲透膜結(jié)晶的影響，并進(jìn)行不同料液流速下蛋白質(zhì)晶體尺寸分布的分析，最后通過顯微鏡照相、紅外波譜對晶體進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在以pH4．7的0．1 mol/L醋酸鈉為緩沖溶液，1%的（NH4）3PO4為沉淀劑的條件下，木瓜蛋白酶較為合適的結(jié)晶條件為：木瓜蛋白酶的濃度為30mg/mL，洗脫液氯化鎂溶液的濃度為25%，溫度控制在15℃，動態(tài)膜結(jié)晶膜組件膜面積為62．83c㎡。當(dāng)

4、對不同流速進(jìn)行考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)溶液和沈脫液流速分別控制在4744μm/s和1．37×104μm/s的高流速時(shí)，有效面積為62．83c㎡的動態(tài)膜組件的效率可得到較好的發(fā)揮，并制得尺寸較大的木瓜蛋白酶晶體。通過顯微鏡照相、紅外分析以及晶體尺寸分布分析表明，在最優(yōu)條件下，晶體尺寸可達(dá)到0．5mm，能夠滿足蛋白質(zhì)衍射分析的需要。 最后，本文采用聚丙烯中空纖維微孔膜對牛血清白蛋白Ⅴ進(jìn)行靜態(tài)膜結(jié)晶研究，考察了不同沉淀劑類型和濃度對牛血清白