版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoooth muscle cell,VSMC)位于動(dòng)脈血管中膜,是血管中層唯一的細(xì)胞成分。VSMC的異常增殖,導(dǎo)致其由中膜遷移到內(nèi)膜下間隙,是冠狀動(dòng)脈硬化、經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)再狹窄以及高血壓血管肥厚等疾病的病理基礎(chǔ)。因此找到VSMC異常增殖的機(jī)制,抑制VSMC異常增殖是治療這些血管肥厚性疾病的重要途徑。
人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase
2、and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因,是具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟、胃腸道、肺臟及皮膚等全身多器官均有表達(dá),且參與多種生理過(guò)程,尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、粘附和遷移均具有重要影響。近年來(lái),對(duì)PTEN的研究逐漸從腫瘤領(lǐng)域延伸到其他領(lǐng)域中,隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)PTEN在心肌肥大,高血壓,動(dòng)
3、脈粥樣硬化,支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。本課題應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,從細(xì)胞和分子水平深入探討AngⅡ是否影響平滑肌細(xì)胞中抑癌基因PTEN的活性和表達(dá)以及其下游信號(hào)通路,發(fā)揮促血管平滑肌細(xì)胞異常增生和遷移的作用。并且初步探討血管平滑肌細(xì)胞增殖中PTEN的表達(dá)如何被調(diào)控。
一、血管緊張素Ⅱ促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移,抑制凋亡
應(yīng)用MTT法,CC
4、K-8法及劃痕實(shí)驗(yàn),證實(shí)AngⅡ可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移,并且確定了AngⅡ的最佳濃度和作用時(shí)間。經(jīng)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,發(fā)現(xiàn)1μmol/L以及10μmol/L兩個(gè)濃度的AngⅡ作用12小時(shí)和24小時(shí)后均能顯著促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖,而0.1μmol/L AngⅡ作用不及另兩個(gè)濃度。1μmol/L AngⅡ增殖促進(jìn)率為12小時(shí)13.6%(p<0.001),24小時(shí)13.9(p<0.01),作用穩(wěn)定。再經(jīng)CCK-8法確證1μmol/L的
5、AngⅡ在24小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性的促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖,12小時(shí)和24小時(shí)對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)率分別為10.4%(p<0.01)和9.8%(p<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,1μmol/L的AngⅡ在12小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性的促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移,12小時(shí)后AngⅡ組平滑肌細(xì)胞遷移的距離約為正常組的1.7倍(p<0.05)。在檢測(cè)AngⅡ影響細(xì)胞活力的同時(shí),應(yīng)用免疫印記法檢測(cè)了細(xì)胞中caspase-3的表達(dá),來(lái)反映細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示,
6、12小時(shí)內(nèi)1μmol/L的AngⅡ可使平滑肌細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性的減少,降低細(xì)胞的凋亡水平。
二、血管緊張素Ⅱ?qū)ζ交〖?xì)胞中PTEN及其通路的影響
實(shí)驗(yàn)應(yīng)用western blot檢測(cè)法及非還原電泳法檢測(cè)AngⅡ刺激細(xì)胞后,PTEN,phospho-PTEN(p-PTEN),reduced-PTEN(re-PTEN),oxidized-PTEN(ox-PTEN)及PTEN下游通路蛋白
7、phospho-Akt(p-Akt)和phospho-FAK(p-FAK)表達(dá)的變化。同時(shí)應(yīng)用Realtime-PCR法檢測(cè)PTENmRNA水平的變化。此外,應(yīng)用還原型二氯熒光素(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的變化,考察自由基水平與re-PTEN和ox-PTEN表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示,0.1μmol/L
8、,1μmol/L以及10μmol/L的AngⅡ分別作用于血管平滑肌細(xì)胞24h時(shí),細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低。選用1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌細(xì)胞0-12h,PTEN的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性的降低,12h時(shí),其表達(dá)降低至正常對(duì)照組的1/4(p<0.001)。RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示1μmol/L AngⅡ刺激細(xì)胞2h后PTENmRNA水平已降低至對(duì)照組的1/2(p<0.01)。說(shuō)明AngⅡ可以從基因和蛋白水平降低P
9、TEN的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。應(yīng)用western blot方法檢測(cè)到,AngⅡ刺激平滑肌細(xì)胞5min后可快速卻短暫的升高p-PTEN的表達(dá),2小時(shí)后趨于正常水平。向細(xì)胞內(nèi)載入DCFH熒光探針,用AngⅡ刺激后不同時(shí)間檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果顯示,AngⅡ刺激平滑肌細(xì)胞可以快速升高細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,1小時(shí)后達(dá)到對(duì)照組的1.5倍(p<0.01),持續(xù)升高2小時(shí)后逐漸降低,12小時(shí)后基本恢復(fù)正常氧化還原狀態(tài)。這與1μmol/L
10、的AngⅡ作用于平滑肌細(xì)胞2h,應(yīng)用非還原電泳檢測(cè)到的ox-PTEN的表達(dá)逐漸升高的結(jié)果具有一致性。1μmol/L的AngⅡ使平滑肌細(xì)胞內(nèi)受PTEN負(fù)調(diào)控的Akt及FAK通路被激活,p-Akt及p-FAK的表達(dá)均呈時(shí)間依賴(lài)性的升高,AngⅡ作用12小時(shí)后p-Akt的表達(dá)升高至正常對(duì)照組的4.5倍(p<0.001);p-FAK的表達(dá)升高至正常對(duì)照組的3.5倍(p<0.001)。
三、血管緊張素Ⅱ影響平滑肌細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)的
11、機(jī)制研究
預(yù)先用某些信號(hào)通路或因子的抑制劑、激動(dòng)劑對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1小時(shí),再加入1μmol/L的AngⅡ共同作用12小時(shí),應(yīng)用western blot和CCK-8法考察各種調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平的影響及對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響,以此分析AngⅡ影響PTEN表達(dá)水平的調(diào)控機(jī)制。western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,AngⅡ受體抑制劑洛沙坦(losartan,Losa),過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxis
12、ome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone,Rosi)及細(xì)胞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制劑BAY11-7082可以使PTEN的表達(dá)恢復(fù)甚至高于正常組PTEN的表達(dá);c-jun氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase,JNK)抑制劑SP600125組PTEN的表達(dá)較AngⅡ組也略有提高;抗氧
13、化劑α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)組細(xì)胞PTEN的表達(dá)與AngⅡ組相比無(wú)明顯變化;而磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002,促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK kinase1/2 or ERK kinase1/2, MEK1/2)抑制劑UO126及p38 MAPK抑制劑SB203580三組細(xì)胞PTEN的表達(dá)較AngⅡ組有不同程度的減少。細(xì)胞經(jīng)相同的處
14、理后,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)各種調(diào)節(jié)劑均對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。NF-κB抑制劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最為明顯,抑制率達(dá)50%;PI3K抑制劑,JNK抑制劑及p38MAPK抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率在20%左右;洛沙坦,羅格列酮及MEK1/2抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率在10%左右;而α-硫辛酸(α-LA)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為4.23%,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
本課題用AngⅡ作為誘因,證實(shí)在血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖和遷移的病理過(guò)程中抑
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf
- 異鉤藤堿對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf
- 血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞增殖和膠原合成的影響及相關(guān)機(jī)制的探討.pdf
- 血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)其前體基因表達(dá)及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究.pdf
- 血管緊張素II刺激血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)TSLP及信號(hào)通路研究.pdf
- 姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的影響.pdf
- 血管緊張素Ⅱ?qū)θ藲獾榔交〖?xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討.pdf
- 皂苷C抑制血管緊張素Ⅱ促血管平滑肌細(xì)胞增殖作用及其機(jī)制研究.pdf
- SM22α在血管緊張素-II誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞收縮中的作用及機(jī)制.pdf
- Caveolae對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制.pdf
- 腎素通過(guò)非血管緊張素Ⅱ途徑促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化.pdf
- 川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ致血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)BMP-2的影響及其機(jī)制探討.pdf
- 腎上腺髓質(zhì)素2對(duì)血管緊張素Ⅱ促血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用.pdf
- Src在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MAPC激活中的作用.pdf
- KLF4調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ1型受體表達(dá)及血管平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf
- 血管緊張素Ⅱ及氧化低密度脂蛋白對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中Smad4表達(dá)的影響.pdf
- 油酰乙醇胺對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖的影響.pdf
- 瘦素調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞鈣化的機(jī)制研究.pdf
- 丹參酮Ⅱ-A對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及p21表達(dá)的影響.pdf
- 血管緊張素Ⅱ及氧化低密度脂蛋白對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞Emilin1表達(dá)的影響.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論