康氏木霉產(chǎn)纖維素酶調(diào)控機制的研究.pdf

1、纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上具有重要地位。進入21世紀，利用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖進而發(fā)酵獲得生物乙醇，可以避免對糧食作物的大量損耗，引起了各國政府和研究機構(gòu)的重視。但由于纖維素酶發(fā)酵活力較低，因此其應(yīng)用成本也較高。闡明纖維素酶的誘導(dǎo)、表達與調(diào)控的機制是當前有關(guān)纖維素酶分子生物學(xué)研究的一個重要方向，有助于通過改進營養(yǎng)策略和生物過程設(shè)計

2、或通過菌株的定向工程改良來提高酶的生產(chǎn)與應(yīng)用，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。目前，有關(guān)纖維素酶的基因克隆與表達的研究與文獻較多，而關(guān)于纖維素酶誘導(dǎo)與調(diào)控的研究較少。本論文從纖維素酶合成受誘導(dǎo)和阻遏雙重調(diào)節(jié)這一角度出發(fā)，研究了康氏木霉產(chǎn)纖維素酶的調(diào)控機理，豐富了現(xiàn)階段此領(lǐng)域的研究內(nèi)容，為下一步菌株的工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。本論文取得的成果總結(jié)如下：
　　 1.利用離心、透析、超濾和Sephadex凝膠過濾等一系列方法從糖

3、蜜酒精廢液分離出一種能誘導(dǎo)纖維素酶產(chǎn)生的物質(zhì)(MASS)。MASS誘導(dǎo)康氏木霉產(chǎn)纖維素酶活力比Mandels對照提高了2.6倍。經(jīng)HPLC分析，MASS是一種新型的糖類物質(zhì)，它由葡萄糖、果糖、木糖按摩爾比6：3：1組成，分子量約為4200 Da。MASS是纖維素酶誘導(dǎo)物這一發(fā)現(xiàn)為我們綜合利用糖廠廢棄物變廢為寶，為糖廠的環(huán)境污染治理提供可靠的理論依據(jù)。也為下一步深入研究其誘導(dǎo)纖維酶合成及基因轉(zhuǎn)錄奠定了基礎(chǔ)。進一步弄清MASS的化學(xué)結(jié)構(gòu)還可

4、為今后篩選廉價、易獲得的纖維素酶誘導(dǎo)物開辟新的途徑。
　　 2.以本室保存的康氏木霉(Trichoderma Knoningii G—39，TK)為出發(fā)菌株，通過對其進行多輪紫外誘變處理，篩選到抗高濃度葡萄糖阻遏突變株TK3，其對葡萄糖的抗阻遏能力較出發(fā)株成倍提高。經(jīng)固體發(fā)酵培養(yǎng)5d后，抗阻遏突變株TK3產(chǎn)FP酶活性、CMC酶活性、CBH酶活性及βG酶活性分別為6.8、52.6、0.91和12.5U/mL，比出發(fā)菌TK提高了2.

5、7、2.4、2.7和5.2倍。通過對菌株TK和TK3葡萄糖吸收速率的比較，指出突變株TK3之所以能夠抗葡萄糖阻遏作用，可能是因為它對葡萄糖的運輸能力有所下降所至。
　　 3.通過分析比較各種碳源誘導(dǎo)康氏木霉纖維素酶酶活和基因轉(zhuǎn)錄的情況，探討了纖維素酶合成與纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系。酶活力分析表明，MASS和其它幾種已知的誘導(dǎo)物一樣對纖維素酶活力的誘導(dǎo)存在著濃度劑量依賴關(guān)系，其誘導(dǎo)纖維素酶CBH活力比槐糖低，但比纖維二糖及乳糖高。同

6、時，Real time PCR分析又證明MASS能誘導(dǎo)cbh基因轉(zhuǎn)錄，其誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平比槐糖低，但比纖維二糖及乳糖高。這些結(jié)果充分說明了各種碳源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)纖維素合成與其誘導(dǎo)纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的水平是相關(guān)的?；碧呛蚆ASS誘導(dǎo)纖維素酶活之所以能高，是因為它們誘導(dǎo)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平高。以上的結(jié)論提示了今后在篩選纖維素酶誘導(dǎo)物時，應(yīng)該注重分析其誘導(dǎo)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 酶活性分析和real time PCR還表明在同種碳源

7、(槐糖，MASS，纖維二糖及乳糖)誘導(dǎo)下，突變菌株TK3的CBH合成和cbh基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于菌株TK，這與菌株TK3抗降解物阻遏表型特征是相一致的。同時也說明突變株TK3可增加誘導(dǎo)物的敏感性，提高酶產(chǎn)量。
　　 4.應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達了康氏木霉纖維素酶的轉(zhuǎn)錄因子ACEI、ACEII及Xyr1的DNA結(jié)合區(qū)，通過分析它們與cbh1啟動子的結(jié)合特性，初步探討了真菌纖維素酶基因的表達調(diào)控機制。EMSA試驗表明Xyr1和ACEI

8、分別通過參與槐糖誘導(dǎo)—特異復(fù)合物和葡萄糖阻遏—特異復(fù)合物的形成而結(jié)合在cbh1啟動子287bp片段的相應(yīng)的位點上。而ACEII不能結(jié)合。提示了槐糖或纖維素誘導(dǎo)康氏木霉cbh1基因表達時起調(diào)控作用的主要是Xyr1，而不是ACEII。
　　 通過對康氏木霉TK和突變株TK3中的兩個主要碳源代謝阻遏因子ACEI和CREI的基因序列和轉(zhuǎn)錄分析，進一步探索了菌株TK3抗降解物阻遏突變的機理。分析表明兩菌株的αce1和cre1基因的序列和轉(zhuǎn)