基于C-Met基因沉默聯(lián)合化療抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是全世界發(fā)病率排名第三的惡性腫瘤，每年有超過100萬患者確診為結(jié)直腸癌，且約有60萬人死于結(jié)直腸癌，其總的5年生存率僅為50-70％。結(jié)直腸癌主要通過脈管方式（淋巴管和血管）向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，部分患者在就診時(shí)已出現(xiàn)淋巴結(jié)及血管轉(zhuǎn)移，這些結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較差。早、中期結(jié)直腸癌的治療手段仍然以手術(shù)治療為主，而中、晚期結(jié)直腸癌則以放化療為基礎(chǔ)聯(lián)合靶向藥物治療為主要手段。目前以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為靶點(diǎn)

2、的兩類靶向藥物在結(jié)直腸癌臨床治療中得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了可喜的效果，但是原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥的問題嚴(yán)重影響了靶向藥物的臨床療效。
　　 c-Met是由原癌基因c-met編碼的是一類重要的酪氨酸激酶受體，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過量表達(dá)，且與腫瘤增殖、遷移、侵襲、腫瘤血管形成及肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其特異性配體為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/離散因子(HGF/SF)。臨床證據(jù)顯示，65％結(jié)腸癌原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶組織中的c-Met的表達(dá)水平明顯高于正常的結(jié)腸黏

3、膜上皮組織，且外周血血清中和腫瘤組織中的HGF表達(dá)水平明顯升高。這些證據(jù)提示了c-Met可以成為結(jié)直腸癌治療的重要靶點(diǎn)，也使得對(duì)基于c-Met的分子靶向治療聯(lián)合傳統(tǒng)放化療在結(jié)直腸癌上抗腫瘤活性和作用機(jī)制的探討至關(guān)重要。
　　 在前期實(shí)驗(yàn)中我們采用慢病毒介導(dǎo)的可調(diào)控誘導(dǎo)小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)技術(shù)，在人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620上建立穩(wěn)定可調(diào)控細(xì)胞系，抑制c-met基因的表達(dá)。適當(dāng)沉默c-Met

4、后，SW620的增殖明顯低于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)則繼續(xù)探討:適當(dāng)沉默c-Met后聯(lián)合傳統(tǒng)化療對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的增殖及遷移的影響。
　　 目的:將構(gòu)建成功含有人c-Met基因可調(diào)控shRNA的重組質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，感染SW620細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定可調(diào)控誘導(dǎo)的細(xì)胞系。探討適當(dāng)敲除c-Met后聯(lián)合化療對(duì)SW620細(xì)胞增殖、遷移的影響。
　　 方法:
　　 1.將pMDL、pRSV、VSVG輔助質(zhì)粒及重組的pSD400

5、-c-Met-shRNA質(zhì)粒按一定比例混合，在Megatran1.0介導(dǎo)下，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，收集病毒液并感染SW620細(xì)胞，利用嘌呤霉素(puromycin)篩選出穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)c-met的shRNA的細(xì)胞株。
　　 2.用多西環(huán)素(Doxycycline)誘導(dǎo)穩(wěn)定細(xì)胞系，用Western-blot和免疫熒光的方法，在蛋白水平檢測(cè)穩(wěn)定可調(diào)控細(xì)胞系c-Met的表達(dá)量。
　　 3.利用Transwell的方法，

6、檢測(cè)適當(dāng)敲低c-Met后SW620細(xì)胞的遷移能力。
　　 4.利用alamar-Blue和Colonyformation的方法，檢測(cè)c-Met敲低后聯(lián)合化療藥對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制。
　　 結(jié)果:
　　 1.用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T進(jìn)行慢病毒包裝，收集48小時(shí)的病毒感染SW620細(xì)胞24小時(shí)，加嘌呤霉素篩選一周，然后將形成的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 2.免疫熒光法結(jié)果顯示，400nM多西環(huán)素可明顯抑制pSD

7、400-c-Met-shRNA-SW620細(xì)胞中c-Met的表達(dá)。
　　 3.用不同濃度（0、1、10、100、400、1000nM）的多西環(huán)素(DOX)誘導(dǎo)pSD400-c-Met-shRNA-SW6203天，Western-blot檢測(cè)c-Met表達(dá)量隨DOX濃度的增加而逐漸下降。用400nM的DOX誘導(dǎo)穩(wěn)定細(xì)胞系3天，Confocal檢測(cè)c-Met的表達(dá)量較未誘導(dǎo)組明顯下降。成功構(gòu)建穩(wěn)定可調(diào)控細(xì)胞株。
　　 4.T

8、ranswell檢測(cè)到適當(dāng)敲低c-Met后，遷移到小室下面的SW620細(xì)胞的數(shù)目較未敲低c-Met組減少。
　　 5.用Colonyformation方法檢測(cè)適當(dāng)敲低SW620細(xì)胞的c-Met表達(dá)后聯(lián)合5-Fu、Taxol，細(xì)胞克隆形成較未敲低組少。
　　 6.用alamar-Blue的方法測(cè)適當(dāng)敲低SW620細(xì)胞的c-Met表達(dá)后聯(lián)合5-Fu對(duì)細(xì)胞的增殖抑制能力增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建針