馬鈴薯StNCED和StPYL基因的克隆與功能分析.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。塊莖是馬鈴薯的繁殖器官，也是產(chǎn)品器官。研究馬鈴薯塊莖形成的調(diào)控機(jī)制，不僅具有理論價(jià)值，而且對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量提高具有指導(dǎo)意義。馬鈴薯塊莖形成是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，并受內(nèi)在因素及外界因素的調(diào)控。外部因素包括光照、溫度、氮水平等;內(nèi)部因素包括光敏色素、轉(zhuǎn)錄因子、植物激素等;研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA后可促進(jìn)馬鈴薯塊莖發(fā)育，提高馬鈴薯產(chǎn)量;在微型薯誘導(dǎo)過(guò)程

2、中，加入外源ABA可顯著增加微型薯的數(shù)量。9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED)是植物內(nèi)源ABA生物合成的關(guān)鍵酶，PYL是最新發(fā)現(xiàn)的一種ABA受體蛋白，在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用。本研究從馬鈴薯中克隆了StNCED1、StNCED2、St YL1和StP YL8基因，并通過(guò)構(gòu)建StNCED2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，初步分析了StNCED2在塊莖形成的作用，主要

3、研究結(jié)果如下:
　　1)采用RT-PCR方法從馬鈴薯栽培品種‘Désirée’中克隆了StNCED1和StNCED2cDNA序列，StNCED1基因的ORF長(zhǎng)度為1812 bp，編碼603個(gè)氨基酸。StNCED2基因的ORF長(zhǎng)度為1743 bp，編碼580個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)分析顯示:StNCED1含有5個(gè)α螺旋、12個(gè)β折疊;StNCED2蛋白含有5個(gè)α螺旋、16個(gè)β折疊;StNCED1和StNCED2蛋白同屬于PLN02258家族，

4、該家族主要編碼9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶蛋白。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，StNCED1與赭黃茄SoNCED進(jìn)化親緣關(guān)系最近，StNCED2與煙草NtNCED3的進(jìn)化親緣關(guān)系最近。在塊莖發(fā)育的前期起始和延伸階段能檢測(cè)到StNCED1表達(dá)，膨大到成熟階段，幾乎檢測(cè)不到StNCED1表達(dá);在塊莖發(fā)育的整個(gè)階段，從起始到成熟階段，均能檢測(cè)到StNCED2表達(dá)，并且在延伸階段表達(dá)量明顯高于其它時(shí)期。
　　2)采用RT-PCR方法從馬鈴薯品種‘Dési

5、rée’中克隆了StPYL1和StPYL8 cDNA序列（GenBank登錄號(hào):KJ660844，KJ660845）。StP YL1基因cDNA開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為696 bp，編碼一個(gè)由231個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白;StPYL8基因cDNA開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為561bp，編碼一個(gè)由186個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。結(jié)構(gòu)分析顯示:StPYL1含有3個(gè)α螺旋、3個(gè)β折疊;StPYL8蛋白含有2個(gè)α螺旋、4個(gè)β折疊;二者均含有START-like結(jié)構(gòu)域

6、;蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)比較顯示，StPYL1與擬南芥 AtPYL1、StPYL8與擬南芥AtPYL9相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，StPYL1與苜蓿MtPYR1、StPYL8與擬南芥AtPYL8親緣關(guān)系較近。組織表達(dá)分析表明，StP YL1和StPYL8在莖葉中均有表達(dá)，StPYL1在莖中表達(dá)最高，StP YL8在葉中表達(dá)強(qiáng)于莖。StPYL1和StPYL8在馬鈴薯塊莖中都有所表達(dá)，但整個(gè)塊莖發(fā)育階段StPYL8表達(dá)量高于StPYL1。外源ABA處理

7、誘導(dǎo)StPYL1和StPYL8上調(diào)表達(dá)，鹽和干旱脅迫對(duì)StPYL8表達(dá)的影響大于對(duì)StPYL1的影響。
　　3)使用pCAMBIA1304載體，構(gòu)建了StNCED2基因的過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1304-StNCED2，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得了7株過(guò)表達(dá)植株。組織表達(dá)分析表明，與野生型對(duì)照相比，StNCED2在轉(zhuǎn)基因植物中葉片、莖和塊莖的不同發(fā)育階段表達(dá)量顯著增加;轉(zhuǎn)基因株系葉片中的內(nèi)源ABA含量與野生型相比