低氧-HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、哺乳動物骨骼系統(tǒng)主要有三種起源，即軸旁中胚層，側(cè)中胚層及神經(jīng)嵴，而依據(jù)成骨方式又可分為：膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨。骨發(fā)育規(guī)律而有序的過程依賴一系列生長因子、生物分子及信號傳導通路的精密而準確調(diào)控。 低氧誘導因子(hypoxia inducible factors，HIFs)包括三種亞型(HIF-1，HIF-2和HIF-3)，目前的研究主要集中于HIF-1及其氧感應元件HIF-1α。低氧誘導因子-1是低氧條件下調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的核心

2、轉(zhuǎn)錄因子，自1992年首次被發(fā)現(xiàn)以來一直為生物學領(lǐng)域研究的熱點。HIF-1α在常氧條件下極不穩(wěn)定，氧依賴降解結(jié)構(gòu)域的脯氨酸發(fā)生羥化，與pVHL(proteinVon Hippel-Lindau)結(jié)合而被蛋白酶體降解。低或缺氧時，HIF-1α聚積并轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)與HIF-1β形成聚合體，激活HIF-1敏感的靶基因進而引起組織細胞一系列的耐氧適應性反應。鑒于骨發(fā)育過程中存在明顯低氧狀態(tài)，探索HIF-1在骨發(fā)育過程中的調(diào)控機制，篩查和分析與其

3、相關(guān)的調(diào)控基因和分子靶標，將有助于提高對骨關(guān)節(jié)發(fā)生發(fā)育的認識、提出骨與關(guān)節(jié)病損防治、監(jiān)控和預測開辟新的措施。 目的：分別在不同細胞水平敲除HIF-1α及其降解識別-VHL，深入探討HIF-1α在骨發(fā)育各個階段的作用及其調(diào)控機制。 方法： (一)在間充質(zhì)細胞水平敲除HIF-1α 1、帶有Dermol啟動子的Cre重組酶的C57/BL6小鼠與HIF-1αflox/floxC57/BL6小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(De

4、rmol-Cre+/- HIF-1αflox/flox)與對照組小鼠(Dermol-Cre-/-HIF-1αflox/flox)。 2、分別取敲除組與對照組胚胎13.5天至P0(新生小鼠)，行組織化學染色、免疫組織化學染色等觀察體內(nèi)間充質(zhì)細胞水平敲除HIF-1α后對骨發(fā)育的影響。 3、取胚胎12.5天HIF-1αflox/flox C57/BL6顱蓋骨，培養(yǎng)間充質(zhì)前體細胞。體外應用Adeno-GFP(對照組)和Adeno

5、-Cre(實驗組)感染，行實時定量熒光PCR、von Kossa和堿性磷酸酶染色、增殖和凋亡檢測、染色體免疫共沉淀等觀察體外間充質(zhì)細胞水平敲除HIF-1α后對骨發(fā)育的影響。 (二)在成骨細胞水平敲除HIF-1α及VHL 1、帶有骨鈣素(OC)啟動子的Cre重組酶的FVB小鼠與HIF-1αflox/floxC57/BL6小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(OC-Cre+/- HIF-1αflox/flox)與對照組小鼠(OC-Cre-/-

6、HIF-1αflox/flox)；帶有骨鈣素(OC)啟動子的Cre重組酶的FVB小鼠與VHLflox/flox FVB小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(OC-Cre+/-VHLflox/flox)。與對照組小鼠(OC-Cre-/-VHLflox/flox)。 2、分別取敲除組與對照組胚胎14.5天(E14.5)至18.5天(E18.5)及出生后6.5天(N6.5)至9.5天(N9.5)，解剖顯微鏡下觀察HIF-1α敲除后，對肢體初級和次級骨化

7、中心和椎體發(fā)育的影響。 3、分別取敲除組與對照組4、8、12周齡肢體和椎體，行組織化學染色、X線、Micro CT、骨小梁面積測量、鈣元素含量、四環(huán)素熒光雙標記、實時定量熒光PCR及Western blotting等觀察HIF-1α及VHL對骨發(fā)育的影響。 結(jié)果：(一)在間充質(zhì)細胞水平敲除HIF-α 1、在間充質(zhì)細胞水平敲除HIF-1α后，胚胎13.5天至P0(新生小鼠)小鼠較對照組體積減小，發(fā)育遲緩。

8、2、體外間充質(zhì)前體細胞敲除HIF-1α后，細胞分化減少而增生增加，骨形成特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx表達降低，HIF-2α表達升高。 (二)在成骨細胞水平敲除HIF-1α及VHL 1、在成骨細胞水平敲除HIF-1α后，敲除組與對照組肢體初級和次級骨化中心和椎體發(fā)育未見明顯差異。 2、在成骨細胞水平敲除HIF-1α后，敲除組軟骨內(nèi)成骨較對照組血管形成減少，新骨形成速度減慢，骨量減少，膜內(nèi)成骨未見明顯影響；敲除V

9、HL后，敲除組軟骨內(nèi)成骨較對照組血管形成增多，新骨形成速度加快，骨量增加，膜內(nèi)成骨未見明顯影響。 結(jié)論： 1、HIF-1α在間充質(zhì)細胞水平敲除導致膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨過程延遲；低氧/HIFα信號通路通過刺激Osx的表達而促進間充質(zhì)細胞分化。 2、HIF-1α在成骨細胞水平對軟骨內(nèi)化骨過程的初級和次級骨化中心發(fā)育未見影響；VHL/HIF-1α信號通路在成骨細胞水平通過調(diào)控血管形成而最終影響軟骨內(nèi)成骨過程，但對膜內(nèi)成